大鼠脊髓損傷后胃腸動(dòng)力的X線研究

蔡暢，李建軍，高峰，楊明亮，杜良杰，楊德剛，劉長(zhǎng)彬，李大鵬，張文豪，徐珮珮

1.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068；2.中國(guó)康復(fù)研究中心北京博愛(ài)醫(yī)院，脊柱脊髓神經(jīng)功能重建科，北京市100068；3.北京腦重大疾病研究院神經(jīng)損傷與修復(fù)研究所，北京市100068；4.北京市神經(jīng)損傷與康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市100068

脊髓損傷可造成嚴(yán)重的軀體感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)功能障礙，還可引起泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等內(nèi)臟功能紊亂，導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥[1-2]。超過(guò)30%的脊髓損傷患者認(rèn)為神經(jīng)源性腸功能障礙(neurogenic bowel dysfunction,NΒD)比膀胱功能障礙和性功能障礙更嚴(yán)重[3]。NΒD主要癥狀包括大便失禁、便秘和排便障礙[4]，對(duì)患者的社會(huì)活動(dòng)和生活質(zhì)量產(chǎn)生極其嚴(yán)重的影響[5]。然而目前關(guān)于NΒD的研究報(bào)道較少，且沒(méi)有關(guān)于脊髓損傷后腸道功能動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)研究。

本研究嘗試建立大鼠脊髓損傷模型，并參考Cabezos等[6-8]使用的X線造影方法，在清醒的大鼠中觀察脊髓損傷前后胃腸道傳輸功能的動(dòng)態(tài)變化，探索NΒD腸道功能變化的新方法并初步探討NΒD的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，為進(jìn)一步豐富和完善NΒD發(fā)生發(fā)展過(guò)程及制定有效的治療方法提供必要的方法學(xué)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只SPF級(jí)健康雌性Sprague-Dawley大鼠，由北京維通利華公司提供，許可證號(hào)SCXK(京)2009-0017，體質(zhì)量(220±10)g。在標(biāo)準(zhǔn)透明籠(60×40×20 cm)中單籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度23℃左右，濕度35%～45%，置于12 h光照/12 h黑暗循環(huán)的環(huán)境中。所有大鼠均定時(shí)定量進(jìn)食，自由飲水，各種試驗(yàn)干預(yù)措施均符合首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理協(xié)會(huì)的要求，倫理審查號(hào)AEEI-2015-079。

1.2 主要試劑與儀器

青霉素：華北制藥股份有限公司。硫酸鋇：青島紅蝶新材料有限公司。數(shù)字X線設(shè)備：西門子公司。Image-lab圖像分析系統(tǒng)：美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 分組和造模

將大鼠分為對(duì)照組(n=12)和脊髓損傷組(n=12)，飼養(yǎng)2周后開(kāi)始制作脊髓損傷模型。

術(shù)前禁食不禁水12 h。大鼠異氟烷氣體吸入麻醉，誘導(dǎo)麻醉濃度3%～4%，維持麻醉濃度1%～2%，流量0.2～0.3 L/min。大鼠全身肌肉松弛，鉗夾肢體無(wú)回縮時(shí)麻醉成功。大鼠背部備皮，俯臥位將四肢固定于手術(shù)操作臺(tái)，以突出的第10胸椎作為骨性標(biāo)志定位至T10節(jié)段脊髓(對(duì)應(yīng)T8)，行后正中切口，長(zhǎng)約2 cm，分離椎旁肌肉后暴露T7～T9棘突，剪斷兩側(cè)的韌帶，小心咬除T8棘突及椎板，暴露硬膜囊并保證其完整，垂直于脊髓縱軸緩慢置入動(dòng)脈瘤夾(標(biāo)定力為70 g)，待動(dòng)脈瘤夾橫跨脊髓后松開(kāi)止血鉗并釋放動(dòng)脈瘤夾，鉗夾脊髓持續(xù)60 s后取出動(dòng)脈瘤夾[9]，被鉗夾處脊髓表面充血、水腫或出血，大鼠尾巴立即痙攣性擺動(dòng)，雙下肢強(qiáng)直陣攣，麻醉蘇醒后大鼠雙下肢弛緩性癱瘓，證明所制作的脊髓損傷模型成功，間斷分層縫合。

對(duì)照組僅暴露硬脊膜后關(guān)閉傷口。

術(shù)后每天予青霉素40萬(wàn)U皮下注射，連續(xù)3 d。每12小時(shí)進(jìn)行一次膀胱按壓，輔助排尿，擠壓直腸輔助排出大便，同時(shí)按摩和被動(dòng)活動(dòng)雙下肢防止壓瘡和血栓形成。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 腸道傳輸功能測(cè)定

造模前和造模后4周，每只大鼠予硫酸鋇懸浮液(2 g/ml,22℃)2.5 ml灌胃。將大鼠放置在可調(diào)整的自制透明塑料管內(nèi)并將其固定于俯臥位，此塑料管大小適中，可使其不能移動(dòng)、轉(zhuǎn)身或逃脫。在造影劑給藥后即刻、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h和24 h，使用數(shù)字X線設(shè)備(60 kV,7 mA)獲得腸道的平面X光片并用Image-lab圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，曝光時(shí)間0.06 s。

在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前訓(xùn)練大鼠適應(yīng)X光室，使其不會(huì)因?yàn)榄h(huán)境改變而出現(xiàn)明顯的胃腸動(dòng)力改變。為了減輕密閉環(huán)境所造成壓力，每次X線造影后立即釋放大鼠(固定持續(xù)2～3 min)。

根據(jù)圖像定量評(píng)分方法分析胃腸運(yùn)動(dòng)功能。見(jiàn)表1。每個(gè)器官(胃、小腸、盲腸和結(jié)直腸)最高分12分，每一分項(xiàng)最高4分。

表1 胃腸功能評(píng)分[6]

1.4.2結(jié)腸HE染色

造模后4周，將大鼠麻醉(方法同前)后，仰臥固定，剪開(kāi)胸骨，暴露縱膈，經(jīng)左心室插穿刺針至升主動(dòng)脈后，剪開(kāi)右心耳，0.9%NaCl液250 ml經(jīng)穿刺針快速滴注5 min，待右心耳流出液清亮；40 g/L多聚甲醛經(jīng)穿刺針灌注固定30 min。大鼠肢體僵硬后，停止灌注，將腹部切開(kāi)，距盲腸2～3 cm處迅速切取結(jié)腸，沿縱軸切開(kāi)，生理鹽水洗滌腸內(nèi)容物。放入10%福爾馬林中固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚4μm，常規(guī)HE染色。光學(xué)顯微鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用(xˉ±s)描述。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組腸道鋇餐評(píng)分的差異性。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

所有實(shí)驗(yàn)大鼠均未出現(xiàn)死亡。術(shù)后約10 d傷口愈合。對(duì)照組精神狀態(tài)佳，自主活動(dòng)良好，飲食和大小便正常。脊髓損傷組雙下肢癱瘓，活動(dòng)量明顯減少；除尿潴留外，大便排出困難，干結(jié)糞便嵌頓在直腸內(nèi)，需擠壓直腸輔助排便。

2.2 脊髓損傷前胃腸運(yùn)動(dòng)功能變化

脊髓損傷前，胃在灌入造影劑后立即開(kāi)始排空，灌胃4 h后已經(jīng)基本完全排空。小腸0 h開(kāi)始顯影，在灌入造影劑后1 h時(shí)顯影更充分。結(jié)腸在灌入造影劑后1～2 h開(kāi)始顯影，并且在4 h左右完全顯影。在某些情況下，在灌胃4 h時(shí)可見(jiàn)糞便顆粒，6 h時(shí)糞便顯影更為明顯。在24 h時(shí)，胃、小腸以及結(jié)腸顯影均不再明顯。見(jiàn)圖1。對(duì)大鼠造模前所得X線圖像進(jìn)行定量評(píng)分，所得結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 脊髓損傷后4周胃腸道運(yùn)動(dòng)功能變化

大鼠脊髓損傷后4周的X線圖像見(jiàn)圖3。各器官在不同時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的排空減慢。

2.3.1 胃

與對(duì)照組相比，脊髓損傷組胃排空速度減慢(P＜0.05)。鋇餐灌胃后4 h，脊髓損傷組胃排空明顯延遲，且胃排空時(shí)間從6 h延遲至8～24 h。見(jiàn)圖4。

2.3.2 小腸

兩組均在灌胃鋇餐后1 h觀察到小腸中的最大顯影強(qiáng)度。鋇餐灌胃后6 h，脊髓損傷組小腸排空速度顯著減慢(P＜0.001)。且小腸排空時(shí)間從8 h延遲至8～24 h完全排空。見(jiàn)圖5。

2.3.3 盲腸

兩組均在灌胃后1 h開(kāi)始顯影，2 h達(dá)到最大評(píng)分。脊髓損傷組盲腸排空速度小于對(duì)照組，對(duì)照組大鼠在24 h基本完成盲腸排空，而脊髓損傷組在灌胃后24 h還能未完全排空(P＜0.001)。見(jiàn)圖6。

2.3.4 結(jié)直腸

兩組均在灌胃后2 h開(kāi)始顯影，4 h達(dá)到最大評(píng)分。脊髓損傷組結(jié)直腸的排空速度小于對(duì)照組，對(duì)照組大鼠在24 h基本完成結(jié)直腸排空，而脊髓損傷組在灌胃后24 h還能未完全排空(P＜0.001)。見(jiàn)圖7。

2.4 結(jié)腸HE染色

脊髓損傷組腸壁萎縮，黏膜糜爛、水腫。炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，腺體減少，肌層較薄以及輕度間質(zhì)水腫。腸絨毛破壞，上皮細(xì)胞壞死，大量滲出，腸絨毛高度下降，數(shù)量減少。見(jiàn)圖8。

圖1 大鼠造模前胃腸運(yùn)動(dòng)功能的X線圖像

圖2 大鼠造模前各器官定量評(píng)分曲線

3 討論

本研究使用非侵入性的X線造影法評(píng)估脊髓損傷后胃腸道傳輸功能動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)胃、小腸、盲腸、結(jié)直腸分別在不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)生傳輸延遲，表明脊髓損傷后胃排空和腸道傳輸功能減弱，傳輸時(shí)間延長(zhǎng)。

脊髓損傷后腸道失去神經(jīng)支配，腸道蠕動(dòng)頻率降低，幅度下降，傳輸時(shí)間延長(zhǎng)，直腸肛門協(xié)調(diào)性紊亂，表現(xiàn)為排便困難、大便失禁等癥狀，是影響患者日常生活質(zhì)量和身心健康的重要因素[10-11]。

1985年Meshkinpour等[12]研究大鼠脊髓橫斷之后靜息結(jié)腸運(yùn)動(dòng)活動(dòng)的變化，結(jié)果表明，結(jié)腸運(yùn)動(dòng)受到脊髓休克的影響，并可能導(dǎo)致結(jié)腸運(yùn)動(dòng)減弱。2001年Gondim等[13]通過(guò)管飼法在清醒大鼠中研究脊髓橫斷損傷后胃排空、腸道轉(zhuǎn)運(yùn)，結(jié)果表明，脊髓橫斷損傷抑制胃排空和腸道轉(zhuǎn)運(yùn)。2015年韓蕓峰等[14]通過(guò)炭末灌胃研究脊髓損傷后NΒD，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后大鼠腸道推進(jìn)率降低。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與之前的相關(guān)研究結(jié)果相一致，說(shuō)明通過(guò)X線方法定量評(píng)估腸道傳輸功能的動(dòng)態(tài)變化具有可信度及可行性。

圖3 大鼠脊髓損傷后4周胃腸運(yùn)動(dòng)功能的X線圖像

圖4 大鼠脊髓損傷后4周胃定量評(píng)分曲線

圖6 大鼠脊髓損傷后4周盲腸定量評(píng)分曲線

圖5 大鼠脊髓損傷后4周小腸定量評(píng)分曲線

圖7 大鼠脊髓損傷后4周結(jié)直腸定量分析評(píng)分曲線

圖8 結(jié)腸HE染色

在脊髓損傷后的腸道功能研究中，腸道推進(jìn)試驗(yàn)、糞便粒數(shù)、糞便含水率測(cè)定、放射影像、核素顯像、酸堿指示劑是研究腸道運(yùn)動(dòng)功能的常用方法[15-17]。與這些方法相比，本研究不需要使用麻醉劑，將清醒的大鼠固定于塑料管中2～3 min進(jìn)行X線拍照，可避免麻醉劑對(duì)胃腸蠕動(dòng)的干擾。實(shí)驗(yàn)前對(duì)大鼠進(jìn)行適應(yīng)訓(xùn)練，訓(xùn)練后大鼠可自行進(jìn)入塑料管中，可避免密閉環(huán)境對(duì)腸道傳輸功能的干擾。總之，本研究采用的X線造影方法不需要麻醉，方法簡(jiǎn)便易行，具有非侵入性，且能夠定量地反映腸道功能的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)脊髓損傷后NΒD的功能變化評(píng)估更加精確。除此之外，本方法可以評(píng)估脊髓損傷后胃腸道不同器官的動(dòng)態(tài)變化情況，也可以為相關(guān)治療方法的研究提供方法學(xué)依據(jù)。

然而，本實(shí)驗(yàn)的研究周期較短，未對(duì)NΒD的腸道傳輸功能的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行長(zhǎng)期觀察；且沒(méi)有對(duì)胃腸道所有器官進(jìn)行病理組織檢測(cè)。未來(lái)應(yīng)將胃腸道的功能變化與病理學(xué)結(jié)果相結(jié)合，進(jìn)一步探討NΒD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

綜上所述，放射攝影技術(shù)不具有侵入性，并能提供胃腸道不同區(qū)域大小和形狀改變的信息。為NΒD研究提供了新的工具。

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