人參皂苷Rb1通過減輕線粒體損傷對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

程斌，楊峰，李鋒濤，林磊，薛建利，吳昊，葉勁濤

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，陜西西安市710004；2.華縣人民醫(yī)院，陜西渭南市714100；3.漢中市中心醫(yī)院，陜西漢中市723000

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury,SCII)指脊髓經(jīng)歷一段時(shí)間的缺血后，血液再灌注后，神經(jīng)功能不僅不能得到改善，反而出現(xiàn)神經(jīng)功能受損加重的現(xiàn)象[1-2]。多種原因可以導(dǎo)致SCII的發(fā)生，如脊柱創(chuàng)傷、血管外科手術(shù)等。脊髓組織屬于神經(jīng)組織，到目前為止，大多數(shù)研究仍認(rèn)為神經(jīng)組織缺血再灌注損傷是一種沒有有效治療方法的疾病。目前一般的處理方法為一旦發(fā)現(xiàn)SCII，立即予大劑量甲基強(qiáng)的松龍、神經(jīng)營養(yǎng)藥物等治療，可以促進(jìn)已受損的脊髓功能恢復(fù)，預(yù)防損傷進(jìn)一步加重[3]。

人參皂苷Rb1是人參皂苷最主要的活性成分之一[4]，具有抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、提高免疫力、減少細(xì)胞腫脹等作用。已有研究顯示，人參皂苷Rb1能明顯減輕腎、腦等臟器缺血再灌注損傷[5]，但在SCII方面報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察人參皂苷Rb1對于SCII后神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷的影響，為今后治療脊髓缺血再灌注損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

成年健康清潔級Sprague-Dawley大鼠134只，體質(zhì)量(213±15)g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 分組

將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為三組。假手術(shù)組(n=12)同其他實(shí)驗(yàn)組一樣接受麻醉、介入操作，但不誘導(dǎo)脊髓缺血。SCII組(n=12)采用Fogarty導(dǎo)管阻斷胸主動脈血流，同時(shí)通過放血法降低血壓，造成大鼠脊髓缺血，缺血10 min后撤去導(dǎo)管，開始再灌注過程，再灌注48 h后處死大鼠。人參皂甙Rb1藥物組(藥物組，n=48)造模方法同SCII，脊髓缺血前30 min腹腔注射人參皂甙Rb1 10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg，每個(gè)劑量組12只，術(shù)后每天腹腔注射相同劑量的人參皂甙Rb1。

1.2 主要儀器及試劑

丙二醛(malonaldehyde,MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性測試盒：南京建成生物工程研究所。動物硬組織活性線粒體分離試劑盒、細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome Coxidase,COX)活性測定試劑盒：上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。多聚甲醛：天津化學(xué)試劑廠。人參皂甙Rb1粉劑：中國藥品生物制品檢定所。

1.3 模型建立

實(shí)驗(yàn)動物術(shù)前禁食一夜。3%苯巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，保持自主呼吸。肛溫探頭置入肛門，動物置于恒溫毯上，保持大鼠體溫維持37.1～37.5℃。取頸正中切口，顯露左側(cè)頸總動脈，置入PE50導(dǎo)管并連接放血裝置及監(jiān)護(hù)儀，監(jiān)測近端動脈壓及心率。在大鼠尾中段上1/3位置顯露尾動脈，置入PE50導(dǎo)管并連接監(jiān)護(hù)儀，監(jiān)測遠(yuǎn)端動脈壓。左側(cè)腹股溝切口，顯露左側(cè)股動脈，遠(yuǎn)端結(jié)扎后輕微牽拉，近端剪一切口，用注射器抽取生理鹽水0.05 ml，將Fogarty導(dǎo)管經(jīng)股動脈置入到胸主動脈高度。全部導(dǎo)管置入結(jié)束后，立即給予肝素鈉200 U。將注射器內(nèi)的生理鹽水0.05 ml推入，避免球囊松弛，同時(shí)立即打開放血裝置放血，在1 min內(nèi)將近端平均動脈壓緩慢降至45 mmHg，并記錄血壓及放血量。脊髓缺血10 min后，松開球囊，立即勻速回輸放血裝置內(nèi)的血液，回輸時(shí)間亦控制在1 min左右。術(shù)后監(jiān)測血壓10 min后取出動脈插管，結(jié)扎動脈，皮下注射硫酸魚精蛋白4 mg。將動物放置于25～30℃保溫箱內(nèi)，等待動物蘇醒后放回飼養(yǎng)籠中。

1.4 大鼠后肢神經(jīng)運(yùn)動功能評分

分別在脊髓缺血再灌注或藥物干預(yù)48 h后，采用ΒΒΒ評分，對各組大鼠后肢神經(jīng)運(yùn)動功能進(jìn)行評分。評分人員為未參加本組實(shí)驗(yàn)而熟悉評分標(biāo)準(zhǔn)人員。

1.5 標(biāo)本采集

動物于脊髓缺血再灌注或藥物干預(yù)48 h后，心臟采血、處死。大鼠3%苯巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，心臟采血3 ml，室溫放置2 h后，1000 r/min離心10 min取血清，置于-20℃冰箱保存。之后升主動脈插管，并剪開右心房，快速灌注生理鹽水250 ml沖洗后，4%多聚甲醛繼續(xù)灌注至右心房流出清亮多聚甲醛、尸體僵硬。立即取出腰段脊髓組織1 cm作為標(biāo)本，將其放入4℃4%多聚甲醛中固定24 h，自來水浸洗24 h，石蠟包埋，于L3節(jié)段2 mm范圍內(nèi)連續(xù)切片，厚10μm。其余部分標(biāo)本用于血清SOD、MDA、COX的檢測。

1.6 血清及脊髓組織中SOD活性測定

采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，嚴(yán)格按照活性測試盒說明書進(jìn)行檢測。

1.7 血清及脊髓組織中MDA含量測定

采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，嚴(yán)格按照測試盒說明書進(jìn)行檢測。

1.8 脊髓組織中COX活性測定

1.8.1 脊髓組織線粒體的提取及其蛋白含量測定

準(zhǔn)確稱取脊髓組織的質(zhì)量，冰上操作，加入適量清洗液清洗后切碎，嚴(yán)格按照動物硬組織活性線粒體分離試劑盒說明書操作。

線粒體懸液采用考馬斯亮蘭法測定其線粒體蛋白含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明測定。

1.8.2 COX活性測定

嚴(yán)格按照COX活性測定試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料采用(xˉ±s)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。顯著性水平ɑ=0.05。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過程中意外死亡6只，其中SCII組4只，藥物組2只。分別在相同條件下予以補(bǔ)充。

2.1 ΒΒΒ評分

與假手術(shù)組比較，SCII組和藥物組ΒΒΒ評分均下降(P＜0.05)。藥物組 ΒΒΒ 評分均高于 SCII組(P＜0.05)。隨著藥物劑量增大，ΒΒΒ評分也相應(yīng)增高，但40 mg/kg與80 mg/kg相比變化不大。見表1。

2.2 血清及脊髓組織中SOD活性

與假手術(shù)組比較，SCII組和藥物組血清及脊髓SOD活性下降(P＜0.05)。藥物組SOD活性均高于SCII組(P＜0.05)。隨著藥物劑量增大，SOD活性也相應(yīng)增高，但40 mg/kg與80 mg/kg相比變化不大。見表1。

2.3 血清及脊髓組織中MDA含量

與假手術(shù)組比較，SCII組和藥物組血清及脊髓MDA含量上升(P＜0.05)。藥物組MDA含量均低于SCII組(P＜0.05)。隨著藥物劑量增大，MDA含量相應(yīng)降低，但40 mg/kg與80 mg/kg相比變化不大。見表1。

2.4 脊髓組織中COX活性

與假手術(shù)組比較，SCII組和藥物組脊髓COX活性下降(P＜0.05)。藥物組COX活性均高于SCII組(P＜0.05)。隨著藥物劑量增大，COX活性也相應(yīng)升高，但40 mg/kg與80 mg/kg相比變化不大。見表1。

3 討論

線粒體通過能量供給、細(xì)胞內(nèi)的鈣平衡、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的生成、促凋亡蛋白釋放的機(jī)制促進(jìn)凋亡，是細(xì)胞死亡的中樞性調(diào)節(jié)因子。主要的線粒體元件包括線粒體外膜及內(nèi)膜，呼吸鏈(復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ)以及復(fù)合體Ⅴ——COX。線粒體膜電位梯度在ATP合成及線粒體鈣平衡維持中起重要作用。細(xì)胞色素C松散結(jié)合在線粒體內(nèi)膜的外表面。超氧自由基是電子傳遞鏈中復(fù)合物Ⅰ的黃素復(fù)合體或者復(fù)合體Ⅲ的泛半醌的自氧化作用中氧化磷酸化的副產(chǎn)物[6]。

缺血再灌注損傷可以導(dǎo)致線粒體損害。整個(gè)過程可以被認(rèn)為是階段性的。早期階段由于缺乏作為電子最終接受體的氧，以及電子傳遞鏈的減少而導(dǎo)致呼吸功能改變，這些改變在中期階段仍可逆[7]。中期階段線粒體功能進(jìn)一步改變，包括細(xì)胞色素C的釋放，以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的可逆性開發(fā)。在該階段已開始為不可逆的線粒體元件損害及細(xì)胞死亡提供了條件[8]。

表1 三組各指標(biāo)比較

氧化應(yīng)激在缺血再灌注損傷的作用已被確定。ROS在缺氧過程中可被看做是一種信號分子，也對細(xì)胞內(nèi)元件造成直接損害。線粒體源性ROS可以損害一個(gè)或多個(gè)呼吸鏈元件，并加速超氧化物的形成，線粒體是細(xì)胞損壞后ROS的主要來源[9]。微量滲析檢測顯示，大腦皮質(zhì)自由基產(chǎn)物在再灌注過程中升高[10]。

在哺乳動物細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)的自由鈣濃度只有細(xì)胞外的1/1000。鈣離子通常通過電壓門控或受體門控鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞，然后與鈣結(jié)合蛋白結(jié)合，進(jìn)入鈣儲備細(xì)胞器，再被鈣泵和離子交換體清除。線粒體蓄積鈣的能力很強(qiáng)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣維持在生理穩(wěn)態(tài)時(shí)，它并不儲備過多的鈣；但是，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣超過0.5 μmol/L時(shí)(鈣超載)，線粒體會將多余的鈣儲存起來[11]。研究顯示，缺血再灌注損傷可以使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度從0.1μmol/L快速升至30～60μmol/L，甚至更高。在大鼠腦組織缺氧/復(fù)氧實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鈣離子進(jìn)入線粒體基質(zhì)，并通過阻斷線粒體的鈣離子傳遞系統(tǒng)介導(dǎo)線粒體損傷[12]。線粒體鈣負(fù)荷動力學(xué)研究顯示[13]，在低氧低糖環(huán)境下，大鼠CA1錐體神經(jīng)細(xì)胞在缺氧時(shí)和缺氧后，自由基產(chǎn)生與線粒體鈣蓄積有關(guān)。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔可以開放，允許所有離子及一些小分子通過。該孔的開放可以引起H+電位梯度崩潰以及ATP產(chǎn)物減少。該孔開放的附加效應(yīng)是鈣離子釋放及氧化磷酸化的解偶聯(lián)，并引起ROS產(chǎn)物的爆發(fā)式產(chǎn)生。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的結(jié)構(gòu)改變可以使線粒體對存在于線粒體內(nèi)的許多促凋亡蛋白的通透性發(fā)生變化。已有實(shí)驗(yàn)觀測到，在缺血再灌注損傷早期可見核轉(zhuǎn)錄因子及谷草轉(zhuǎn)氨酶的釋放。在腦組織缺血、局部缺血等條件下，亦可觀測到細(xì)胞色素C從線粒體到胞漿的再分布[14-15]。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷中有氧化應(yīng)激機(jī)制參與[16-17]。實(shí)際上，脂質(zhì)過氧化物、過氧化氫等在損傷急性期已經(jīng)升高。氧化應(yīng)激是細(xì)胞內(nèi)氧化物與抗氧化物之間的平衡被打破形成的，對組織有損害作用，可能是造成神經(jīng)細(xì)胞損傷的原因之一。神經(jīng)組織富含不飽和脂肪酸，對自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用非常敏感，而此時(shí)抗氧化酶如過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶等的含量很低[18]。同時(shí)，氧化應(yīng)激還可以損傷線粒體功能[19]。

SOD是廣泛分布于各種生物體內(nèi)的重要的抗氧化酶，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)[20]，是生物體抗氧化能力的首選觀測指標(biāo)。所以，諸多學(xué)者在缺血再灌注損傷試驗(yàn)中使用SOD活性作為氧化應(yīng)激損害程度的直觀指標(biāo)[21]。MDA可以由乙醛和甲酸乙酯縮合生成。在生物體內(nèi)，自由基的脂質(zhì)過氧化作用終產(chǎn)物即為MDA，可以引起許多生物大分子的交聯(lián)，具有細(xì)胞毒性。MDA也是缺血再灌注損傷過程中氧化應(yīng)激損害的一個(gè)重要監(jiān)測指標(biāo)，廣泛應(yīng)用于此類實(shí)驗(yàn)[22]。SOD通過催化O2-歧化反應(yīng)，發(fā)揮抗氧自由基的作用，增強(qiáng)H2O2濃度的調(diào)節(jié)功能，保護(hù)組織細(xì)胞。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合，兩者是反映脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度的重要指標(biāo)，結(jié)果分析有助于準(zhǔn)確掌握脊髓損傷程度。

COX由13個(gè)亞基組成，是呼吸鏈末端成員及其限速酶。其基因有線粒體編碼部分(3個(gè)亞基：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)及細(xì)胞核編碼部分(10個(gè)亞基：Ⅳ、Ⅴa、Ⅴb、Ⅵa、Ⅵb、Ⅵc、Ⅶa、Ⅶb、Ⅶc、Ⅷ)。核基因編碼的組織特異性亞基與不同組織的能量需求有關(guān)。ATP與ADP的比例可以調(diào)節(jié)COX的活性。ATP作為一種變構(gòu)抑制物，具有第二種呼吸調(diào)控機(jī)制，以對抗第一種呼吸調(diào)控機(jī)制。ATP抑制COX的變構(gòu)提示，可以通過信號傳遞途徑來對其亞基進(jìn)行可逆性的磷酸化，從而調(diào)節(jié)COX的活性[23]。COX可以通過其亞基的磷酸化來調(diào)控其活性，亞基Ⅰ第304位酪氨酸的磷酸化可以導(dǎo)致COX活性的明顯降低[24]。COX的Ⅴa亞基與3,5-二碘甲狀腺氨酸結(jié)合、內(nèi)源性NO或脂質(zhì)過氧化物的生成，可以影響ATP對于COX的變構(gòu)抑制作用，但這種影響在應(yīng)激條件下很快被消除。

在缺氧條件下，線粒體編碼的COX亞基Ⅰ、Ⅱ及細(xì)胞核編碼的亞基Ⅳ、Ⅴb的mRNA出現(xiàn)相應(yīng)的表達(dá)下調(diào)，這被認(rèn)為與線粒體轉(zhuǎn)錄因子A的減少有關(guān)。另外，酶構(gòu)成及活性的變化伴隨著細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的變化。COX的Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ亞基在缺血再灌注損傷中特異性磷酸化可以導(dǎo)致COX的功能受損。研究顯示，在缺血再灌注損傷中，亞基Ⅰ、Ⅴ明顯下降，通過缺血預(yù)處理僅能部分緩解這種趨勢[25]。COX可以作為缺血再灌注過程中線粒體損傷的一個(gè)重要標(biāo)志。

人參皂苷Rb1是人參中達(dá)瑪烷型三萜皂苷類化合物，具有多種生物活性，對人參皂苷Rb1代謝產(chǎn)物的分析已有報(bào)道，在大鼠尿液、糞便、胃和大腸中共檢出14種代謝產(chǎn)物[26]。通過靜脈注射藥物后，尿液中排出主要為原型藥物，也包含部分代謝產(chǎn)物。血液中藥物達(dá)峰時(shí)間約為1.02 h。通過口服給藥生物利用度低，進(jìn)入血液的原型藥物較少，在此基礎(chǔ)上發(fā)生的水解、結(jié)合、氧化和異構(gòu)化等代謝反應(yīng)也微乎其微?？诜o藥后尿液中檢測到的代謝產(chǎn)物多為進(jìn)入體內(nèi)的胃腸道菌群代謝產(chǎn)物，其中水解產(chǎn)物居多，形成多個(gè)脫糖的代謝產(chǎn)物，在尿液中，水解代謝產(chǎn)物的量高于原型藥物。本實(shí)驗(yàn)中選用腹腔注射藥物，一方面保證血藥濃度，另一方面保證足夠藥物在肝臟中進(jìn)行代謝反應(yīng)。有人使用1200 mg/kg口服藥物濃度進(jìn)行試驗(yàn)，得出結(jié)果血藥濃度1～20.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，之后上升趨勢減緩[27]?？紤]腹腔吸收藥物較口服生物利用率高，但仍有部分損失，所以實(shí)驗(yàn)組中20 mg/kg組未達(dá)最好效果。40 mg/kg組扣除固定損失部分后可能已達(dá)到血藥濃度上限，同理80 mg/kg組也達(dá)上限，所以40 mg/kg組與80 mg/kg組從各方面評價(jià)效果差距不大。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單純的大鼠脊髓缺血再灌注損傷可以使脊髓組織的COX活性明顯降低，血清及脊髓組織的SOD活性明顯降低，MDA含量升高；說明大鼠脊髓缺血再灌注損傷即會引起明顯的線粒體損傷及氧化應(yīng)激。藥物組各劑量組值雖都較假手術(shù)組降低，但與SCII組相比，COX活性和SOD含量升高，MDA含量下降，且這種改變隨藥物劑量增大而愈加明顯，但在干預(yù)劑量大于40 mg/kg后這種趨勢不再明顯。這證實(shí)人參皂甙Rb1干預(yù)可以促使大鼠COX活性提高，SOD活性提高，MDA生成減少，且這種變化趨勢在干預(yù)劑量小于40 mg/kg時(shí)呈劑量依賴。

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