消毒時間和激素水平對豆瓣菜組織培養(yǎng)的影響

馬紹鋆　方凌　余瓊芳

摘 要：該文以豆瓣菜腋芽為外植體，研究消毒時間和激素水平對豆瓣菜初代培養(yǎng)的影響，探討豆瓣菜快速繁殖試管苗的途徑。結(jié)果表明：豆瓣菜腋芽為外植體的最佳消毒時間為9min。豆瓣菜最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.25mg·L-1，其腋芽增殖率最高為95.2%；轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS+NAA2.5mg·L-1的第60d時，生根率為100%，移栽后，成活率為100%。

關(guān)鍵詞：豆瓣菜；消毒時間；激素水平；組織培養(yǎng)

中圖分類號 S645.9 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）02-0025-03

Abstract：The experiment investigated the effect of different sterilize time and hormone content on tissue culture of Naturtium officinale with the axillary shoots as explantlets，and discussed the available methodology on rapid propagation of Naturtium officinale.The results showed that the optimum sterilize time of axillary shoots is 9 min. The best medium of axillary shoots induction is MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0. 25 mg·L-1，its axillary shoots induction is 95.2%， which is the highest； in the medium of rooting which is MS+NAA2.5 mg·L-1，and 60 days later the rooting rate is 100%， the survival rate after transplantation is 100%.

Key words：Watercress；Sterilize time；Hormone content；Tissue culture

豆瓣菜（Naturtium officinale R.Br.），又名西洋菜、水田芥、水芥菜，屬十字花科豆瓣菜屬多年生水生蔬菜，原產(chǎn)于歐洲地中海東部和南亞熱帶地區(qū)，其莖葉清香而略帶辣味，具有食用價值[1]和獨特的藥用價值[2]，同時對富營養(yǎng)化水體有重要的生態(tài)修復(fù)作用[3-4]，近年來其需求量不斷增加。葉元英等[5]研究發(fā)現(xiàn)，武漢地區(qū)有些豆瓣菜品種能開花結(jié)實，而有些品種則不能開花結(jié)實。張楠等[6]發(fā)現(xiàn)，黑龍江野生豆瓣菜具有耐寒和易栽培的特點，但不易獲得種子。對于可以開花結(jié)實的品種可以采用有性繁殖和無性繁殖，而不能開花結(jié)實或不易獲得種子的品種則需進行無性繁殖獲得大量種苗，同時長期采用扦插繁殖方式會導(dǎo)致品種退化。因此，探索豆瓣菜腋芽的最佳消毒時間和腋芽的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基，可為豆瓣菜試管苗再生體系的建立和大規(guī)模生產(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 新鮮豆瓣菜（Naturtium officinale R.Br.）帶腋芽的莖段取自安徽省舒城縣水生蔬菜種植基地。取樣時間為2017年3月下旬。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 外植體的選取 將豆瓣菜帶腋芽的莖段用刷子在流水下刷洗干凈后，再置于流水下沖洗12h，備用。

1.2.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 誘導(dǎo)培養(yǎng)基：（1）MS+

6-BA2.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1，（2）MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1，（3）MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1，（4）MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.25mg·L-1，（5）MS+

6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，生根培養(yǎng)基：（6）MS+NAA2.5mg·L-1。以上培養(yǎng)基含有MS干粉4.74g·L-1、蔗糖30g·L-1，瓊脂粉0.8%[（6）號培養(yǎng)基除外）]，pH5.8。接種材料培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，誘導(dǎo)期間采用漫射光培養(yǎng)，增殖和生根培養(yǎng)為光照12h·d-1，光強為20μmol·m-2·s-1，相對濕度為（60±10）%的條件下進行。

1.2.3 試驗處理 在超凈臺上將豆瓣菜腋芽用小刀片切下，放入無菌小燒杯中，先加入70%乙醇消毒30s后，再用2.5%NaClO分別消毒5、6、7、8、9、10min，之后用無菌水沖洗4次，每次5min，獲得無菌材料。將腋芽接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，觀察消毒時間對豆瓣菜腋芽出芽率、污染率和褐化率的影響。每瓶接4個腋芽，每個處理10瓶，3次重復(fù)，2～3d觀察一次，記錄并統(tǒng)計結(jié)果。在明確最佳消毒時間后，將豆瓣菜腋芽分別接種于1～5號誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，觀察腋芽增殖情況，確定最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基。待腋芽增殖為叢生芽后，轉(zhuǎn)入6號生根培養(yǎng)基中，統(tǒng)計5、10、15、25、35、45、60d豆瓣菜生根率。其中增殖率（%）=（增殖后的叢芽數(shù)-增殖前的叢芽數(shù)/增殖后的叢芽數(shù)）×100，生根率（%）=（生根的外植體/接種外植體總數(shù)）×100。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行方差分析；用Duncans新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時間對豆瓣菜叢生芽誘導(dǎo)的影響 豆瓣菜為水生植物，由于生長環(huán)境特殊而帶有大量雜菌，因而在離體培養(yǎng)過程中有效控制雜菌是獲得試管苗的關(guān)鍵。將豆瓣菜腋芽接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，第5天時腋芽開始萌動。由表1可知，隨著消毒時間的增加，豆瓣菜平均出芽率呈現(xiàn)“降-升-降”的變化趨勢，其中在消毒時間為9min時，平均出芽率達到最大值，為24.36%，與消毒時間為5min、6min、7min、8min、10min時的平均出芽率之間存在極顯著差異（P<0.01），而7min與10min時的平均出芽率之間無顯著差異（P>0.05）。平均污染率在消毒時間為8min、9min、10min時很低，三者之間無顯著差異（P>0.05），與5min、6min、7min之間存在極顯著差異（P<0.01），此時外植體褐化比較嚴(yán)重，平均死亡率也較高，其中在10min時，達到最大值，為55.90%；5min時，平均污染率最高，為30.19%。平均褐化率在7min、8min、9min、10min時均極顯著（P<0.01）高于5min和6min，而7min、8min、9min、10min四者之間無顯著差異（P>0.05）。平均死亡率在5min、8min和9min時很低，與6min、7min和10min之間存在極顯著差異（P<0.01），其中在9min時，平均死亡率最低，為46.21%。綜合考慮，得出豆瓣菜腋芽的最佳消毒時間為9min。

2.2 激素水平對豆瓣菜叢生芽增殖的影響 由圖1可知，在1、2和3號培養(yǎng)基NAA濃度相同的條件下，隨著6-BA濃度的增加，豆瓣菜腋芽的增殖率呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢；在4號和5號培養(yǎng)基6-BA濃度相同的條件下，隨著NAA濃度的增加，豆瓣菜腋芽的增殖率則呈現(xiàn)逐漸下降的變化趨勢，從總體來看，3、4和5號培養(yǎng)基的腋芽增殖率要極顯著（P<0.01）高于1號和2號培養(yǎng)基，其中4號培養(yǎng)基中腋芽增殖率最高，為95.2%。由此可見，豆瓣菜腋芽增殖的最適培養(yǎng)基為4號培養(yǎng)基：MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.25mg·L-1。

2.3 豆瓣菜試管苗生根培養(yǎng) 將誘導(dǎo)的芽叢轉(zhuǎn)入4號培養(yǎng)基進行增殖，30d后用解剖刀切開分化的豆瓣菜芽叢，轉(zhuǎn)入6號生根培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)生根培養(yǎng)。由表2可知，豆瓣菜在培養(yǎng)第15d時開始生根，隨著培養(yǎng)時間的延長，豆瓣菜的平均主根長、平均根數(shù)以及平均生根率都呈現(xiàn)逐漸遞增的變化趨勢，其中在培養(yǎng)第60d時，平均生根率達到最大值，為100%。此外，在生根培養(yǎng)過程中，第25d時主莖上有少量氣生根出現(xiàn)。

2.4 豆瓣菜煉苗移栽 將在培養(yǎng)室已經(jīng)進行5d環(huán)境適應(yīng)性鍛煉的豆瓣菜苗放置于培養(yǎng)室外，打開培養(yǎng)瓶蓋進行煉苗，期間每隔2d換一次清水，待豆瓣菜有新芽長出后即可移栽。由于豆瓣菜不耐熱，因此夏季不宜進行室外移栽。選擇溫度適宜的秋季晴天上午，將豆瓣菜從培養(yǎng)瓶中取出，用清水把根部沖洗干凈后，移栽至裝有肥沃園土的泥池中，澆透水，保持濕度在95%以上，14d后移栽成活率達100%。

3 結(jié)論與討論

豆瓣菜為水生蔬菜，在自然生長環(huán)境下極易受到雜菌污染，離體培養(yǎng)過程中外植體表面消毒和之后內(nèi)生菌抑制的難度都高于其它植物。研究發(fā)現(xiàn)水生植物莖的維管束出現(xiàn)退化且缺乏木質(zhì)和纖維，其表皮對殺菌劑的通透性強，對殺菌劑敏感，消毒難度大[7]，消毒時間過短，會導(dǎo)致污染；消毒時間過長則會導(dǎo)致材料褐化甚至死亡。此外，外植體類型的選擇是組織培養(yǎng)的首要環(huán)節(jié)，張楠等[6]以黑龍江野生豆瓣菜嫩莖為外植體，通過誘導(dǎo)愈傷組織后再分化成苗，建立了嫩莖無性系。因此，選擇合適的外植體和準(zhǔn)確把握消毒時間是豆瓣菜再生體系建立的前提條件。本試驗以豆瓣菜腋芽為外植體研究發(fā)現(xiàn)，隨著消毒時間的延長，平均污染率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，其平均出芽率呈現(xiàn)“降-升-降”的變化趨勢，但總體都不高且平均褐化率和平均死亡率也較高。綜合以上因素，得出豆瓣菜腋芽的最佳消毒時間為9min。

離體培養(yǎng)過程中，外源激素的種類、濃度及其組合配比對不同植物材料不定芽的誘導(dǎo)存在一定的差異[8]，趙楊陽等[9]在對家獨行菜愈傷組織的叢生芽誘導(dǎo)時發(fā)現(xiàn)，6-BA作為主效植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在濃度為1.5mg·L-1時誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率高達89.9%。吳秀燕等[10]研究發(fā)現(xiàn)6-BA和NAA共同使用對美國流蘇莖段不定芽誘導(dǎo)效果較好，誘導(dǎo)率高達86.8%。本試驗以MS為基本培養(yǎng)基，通過添加不同濃度6-BA和NAA，對豆瓣菜腋芽進行不定芽的誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)，探討其試管苗快繁技術(shù)途徑。經(jīng)研究得出，以豆瓣菜腋芽為適宜外植體，豆瓣菜腋芽增殖的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.25mg·L-1，增殖率為95.2%，試管苗在MS+NAA2.5mg·L-1液體培養(yǎng)基上生根效果較好，在第60d時生根率達到100%，這些可為豆瓣菜的大規(guī)模種苗生產(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。這與張楠等[6]以長度為0.5cm以上的豆瓣菜不定苗轉(zhuǎn)入1/2MS+IAA0.2mg/L生根培養(yǎng)基后，其生根率為100%結(jié)果是一致的。葉元英等[5]研究發(fā)現(xiàn)，以豆瓣菜匍匐莖的莖節(jié)中段扦插成活率高且分枝快，中段莖節(jié)不定根長，生長旺盛，這可能與各莖節(jié)段不定根的發(fā)生和長勢有關(guān)。

豆瓣菜作為一種從國外引進的水生蔬菜，具有清香可口、營養(yǎng)豐富等特點，同時具有降血糖、抗腫瘤、抗血小板聚集以及抑菌殺菌等藥理作用[11-12]，近年來備受關(guān)注。因此，豆瓣菜再生體系的建立，在較短時間內(nèi)獲得大量試管苗，對于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)具有重要意義。此外，本試驗采用離體培養(yǎng)技術(shù)對水生蔬菜—豆瓣菜進行離體試管保存，該技術(shù)在節(jié)省大量土地和降低人工成本的同時，又可防止豆瓣菜長期保存于田間而導(dǎo)致品種退化和病蟲害感染，確保保存資源的種性不發(fā)生改變[13]，對保存優(yōu)良種質(zhì)起到重要作用，也為豆瓣菜優(yōu)良品種的選育提供技術(shù)支持。

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（責(zé)編：張宏民）