基于GPER/PI3K/AKT通路探究四物湯對成骨細胞的雌激素樣效應(yīng)及其分子機制＊

盧 迪，崔麗霞，石丹寧，陳 夢，楊 陽，牛建昭，趙丕文

（北京中醫(yī)藥大學生命科學學院 北京 100029）

四物湯，源于宋《太平惠民和劑局方》，由熟地、當歸、白芍與川芎組成，具有補血、養(yǎng)血功效，用于治婦人諸疾，尤其沖任虛損所致各種婦科病證。作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，近年來多項實驗研究表明，四物湯及其組方有一定的雌激素樣作用，本課題組在研究中也發(fā)現(xiàn)，四物湯可通過核受體ER途徑發(fā)揮雌激素樣作用[1]。GPER是新型雌激素受體，四物湯是否通過GPER途徑發(fā)揮雌激素效應(yīng)尚不明確，本實驗旨在在既往研究的基礎(chǔ)上深入探索四物湯是否經(jīng)GPER介導(dǎo)途徑發(fā)揮雌激素樣效應(yīng)及其可能分子機理。

1 材料

1.1 實驗動物

健康雌性SD大鼠，出生后21天，體質(zhì)量50 g，SPF級，斯貝福實驗技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK（京）2016-0002。動物飼養(yǎng)在溫度適宜、自然光照動物室內(nèi)。

1.2 實驗藥物

四物湯組方：熟地15 g，當歸10 g，白芍10 g，川芎6 g，藥物顆粒劑購自北京中醫(yī)藥大學附屬東方醫(yī)院，按體質(zhì)量折算大鼠灌胃劑量（總生藥材質(zhì)量）為6.6 g·kg-1。陽性藥物戊酸雌二醇（商品名：補佳樂）為拜耳醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號：195A5。

1.3 實驗儀器和器材

低溫離心機（3K15，SIGMA）、超凈工作臺（022-2522，北京亞泰隆實驗技術(shù)中心）、倒置顯微鏡（TS100，NIKON），CO2培養(yǎng)箱（（MCO-20AIC，日本SANYO）、超凈工作臺（022-2522，北京亞泰實驗技術(shù)中心）、多功能熒光酶標儀（SAFIRE2，TECAN），倒置熒光顯微鏡（IX71，OLYMPUS）、NuncTMLab-TekTM腔室載玻片系統(tǒng)（Thermo Scientific）。

1.4 實驗試劑

α-MEM培養(yǎng)基（Hyclone），活性炭-葡聚糖處理的胎牛血清（CDT-FBS）（Cellgro，澳洲），0.25%胰蛋白酶（gibico），膠原酶Ⅰ（investergen），堿性磷酸酶染色試劑盒（鈣鈷法）（南京建成科技有限公司），激動劑G1、拮抗劑G15（Cayman公司），MTT（solarbio），DMSO（ACS Grade），4%多聚甲醛（南京凱基生物有限公司），PI3K抗體（proteintech）、AKT抗體（abcam）、p-Akt抗體（Cell Signaling Technology），DAPI染色液（solarbio），Anti-RabbitIgG-FITC二抗、Anti-MouseIgG-FITC二抗、Anti-RabbitIgG-TRITC二抗（北京中杉金橋有限公司）。

2 方法

2.1 實驗分組和給藥

40只雌性SD大鼠，按照隨機分組的原則分為5組：正常對照組、雌激素組和四物湯高、中、低劑量組。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，給予灌胃給藥。（1）正常對照組：灌胃生理鹽水；（2）雌激素組：灌胃補佳樂，0.16 mg·kg-1·d-1；（3）四物湯高劑量組：灌胃四物湯2.08 g·kg-1.d-1；（4）四物湯中劑量組：灌胃四物湯1.04 g·kg-1·d-1；（5）四物湯低劑量組：灌胃四物湯0.52 g·kg-1·d-1。每天早、晚灌胃，持續(xù)4天。

2.2 制備含藥血清

各組動物最后1次灌胃3 h后稱重，腹腔麻醉后，腹主動脈取血，4℃過夜，3 000 rpm離心10 min，收集血清，0.22 μm無菌濾器過濾，56℃、30 min滅活補體，-20℃保存。

2.3 成骨細胞提取和培養(yǎng)

在乳鼠出生后72 h內(nèi)提取原代成骨細胞，提取細胞所用器械均已在使用前高壓滅菌。SD乳鼠浸泡于75%酒精中消毒10 min左右，移入超凈工作臺，取其顱骨并剝離干凈，剪碎、消化后離心收集骨片，加入0.5%膠原酶Ⅰ，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h左右；離心，棄上清液，加入α-MEM（含10%CDT-FBS）培養(yǎng)基，充分吹打后，離心或靜置5 min，取上清，放入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)[2]。

2.4 成骨細胞的形態(tài)學觀察和堿性磷酸酶（ALP）活性鑒定

取第2代ROBs，觀察細胞形態(tài)，并拍照記錄；另取部分細胞消化、離心，以5×103個/孔接種于24孔板中，待細胞生長至80%時，吸棄培養(yǎng)液后，以4%多聚甲醛固定細胞，按照堿性磷酸酶染色試劑盒說明書（鈣鈷法）染色，并在倒置顯微鏡下拍照記錄。

2.5 細胞增殖實驗

選取第2或3代的ROBs細胞，加入α-MEM（含10%CDT-FBS）培養(yǎng)基，在細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，PBS洗滌2次，用0.25%胰蛋白酶消化5 min，加入α-MEM完全培養(yǎng)基，以3×103個/孔的細胞密度接種于96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)液總體積為100 μL。細胞貼壁后，換為含10%含藥血清的DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)；同時設(shè)置激動劑組、拮抗劑組，即在加入含藥血清之前1 h加入GPER激動劑G1或拮抗劑G15，濃度為10-8mol·L-1。每組設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)置調(diào)零組（只加培養(yǎng)基，不加細胞）。在加藥24 h后，避光加入MTT（5 mg·ml-1，14 μL/孔），繼續(xù)孵育4 h后，每孔加入150 μLDMSO，避光在搖床上搖動10 min。以DMSO調(diào)零，用酶標儀測定各孔490 nm下吸光度值并記錄。

2.6 細胞免疫熒光實驗

細胞培養(yǎng)條件同2.5。選取第2或3代ROBs，以5×103個/孔的細胞密度接種于腔室載玻片系統(tǒng)中，細胞貼壁后，換為含10%含藥血清的DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時設(shè)置激動劑組、拮抗劑組。培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定20 min，0.03%Trinton-100透膜10 min，5%山羊血清封閉30 min后分別加入PI3K、AKT、p-Akt一抗，4℃過夜；第二天將載玻片恢復(fù)至室溫，吸棄一抗，洗后避光加入Anti-RabbitIgG-FITC二抗、Anti-MouseIgG-FITC或Anti-RabbitIgG-TRITC二抗，室溫30 min；洗后避光加入DAPI染液10 min，倒置熒光顯微鏡拍照記錄[3]。

2.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS20統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差（xˉ±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD法。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 成骨細胞的形態(tài)學特征（×400）

圖2 堿性磷酸酶染色（×400）

表1 四物湯含藥血清對ROBs增殖速率的影響（xˉ±s，n=5）

表2 四物湯含藥血清對ROBs中PI3K、AKT、p-Akt平均熒光強度表達的影響（xˉ±s，n=3）

3 結(jié)果

3.1 成骨細胞的形態(tài)學特征和堿性磷酸酶活性鑒定

由圖1和圖2可知，在顯微鏡下觀察，ROBs細胞呈現(xiàn)梭形或多邊形形態(tài)，多突起；通過堿性磷酸酶染色發(fā)現(xiàn)，ROBs細胞胞質(zhì)中陽性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆粒或塊狀、條狀沉淀。

3.2 四物湯含藥血清對ROBs細胞增殖的影響

由表1可知，與正常對照組相比，雌激素含藥血清可使ROBs細胞增殖速率顯著增加（P＜0.01）；與雌激素的作用趨勢類似，四物湯高、中、低劑量組含藥血清也可使ROBs細胞增殖速率明顯增加（P＜0.01），并具有一定的劑量依賴性。該促細胞增殖的作用在加入GPER激動劑G1后可被進一步增強（P＜0.01）；而在加入GPER拮抗劑G15后，四物湯含藥血清各劑量組促進細胞增殖的作用均被明顯拮抗（P＜0.05或P＜0.01）。

3.3 四物湯含藥血清對ROBs PI3K、AKT、p-Akt表達的影響

圖3 四物湯含藥血清對ROBs PI3K表達的影響（FITC染色×400）

由表2和圖3、圖4、圖5的結(jié)果可知，雌激素組含藥血清對ROBs中PI3K、p-Akt的平均熒光表達強度有促進作用（P＜0.01），在四物湯高劑量含藥血清作用后，ROBs細胞中PI3K、p-Akt的平均熒光強度高于正常對照組的平均熒光強度（P＜0.05或P＜0.01），在加入激動劑G1后，其表達強度相比高劑量組進一步增強（P＜0.05或P＜0.01），在加入拮抗劑G15后，其表達強度相比高劑量組明顯減弱（P＜0.05）；而總AKT的平均熒光強度在五組中表達程度相當，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

4 討論

四物湯作為婦科補血調(diào)經(jīng)的經(jīng)典方劑，本實驗證明其可通過GPER通路發(fā)揮雌激素樣效應(yīng)，促進成骨細胞增殖，提高GPER介導(dǎo)下游信號分子PI3K、p-Akt的表達水平。

圖4 四物湯含藥血清對ROBs AKT表達的影響（TRITC染色×400）

成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。功能活躍的成骨細胞內(nèi)堿性磷酸酶組織化學染色陽性[2]，大量的實驗研究表明，ALP可用作成骨細胞的鑒定和細胞分化的標志之一。本實驗結(jié)果與文獻報道一致，即通過堿性磷酸酶染色發(fā)現(xiàn)，ROBs細胞質(zhì)有灰黑色染色顆粒。

圖5 四物湯含藥血清對ROBs p-Akt表達的影響（FITC染色×400）

雌激素在骨代謝中發(fā)揮著重要作用，40年前，科學家們首次在體外培養(yǎng)的成骨細胞上發(fā)現(xiàn)了雌激素受體，并在蛋白水平和mRNA水平上證明了雌激素對成骨細胞的影響[4-5]。雌激素通過直接結(jié)合ER或者間接作用可促進成骨細胞的增殖和骨形成，抑制破骨細胞的分化和促進其凋亡等[6]。近年來，除經(jīng)典雌激素核受體之外，一種新型雌激素膜受體—GPER的發(fā)現(xiàn)為雌激素效應(yīng)分子機理的研究提供了新的思路。不同于經(jīng)典雌激素核受體的核效應(yīng)，GPER不僅能介導(dǎo)雌激素快速非基因組效應(yīng)，也可間接參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，通過影響下游信號分子的表達發(fā)揮其調(diào)控機制。GPER介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要包括PI3K途徑、cAMP途徑、MAPK途徑、IP3-Ca2+途徑等[7]。近年來關(guān)于GPER在骨代謝中的機制研究日益增多。在成骨，破骨和骨細胞中均表達GPER，但在雌鼠的脂肪、子宮等生殖系統(tǒng)[8]和皮質(zhì)骨小梁骨中，其作用不明顯[9]。在體動物實驗結(jié)果證明，GPER激活能夠提高卵巢摘除后大鼠的骨密度，發(fā)揮調(diào)節(jié)骨代謝功能[10]；體外細胞實驗表明，GPER可通過激活PI3K/AKT、MAPK（ERK、p38、JNK）以及cAMP-PKA-CREB等信號通路影響ROBs細胞的增殖與分化[8]。雌激素與缺乏ER受體的人胚胎成骨細胞（hFOB）上的GPER結(jié)合后，可通過激活下游MAP激酶介導(dǎo)促進成骨細胞的增殖，發(fā)揮骨保護作用[11]。進一步的研究表明，GPER激活后可介導(dǎo)多方面的雌激素樣作用，對脊髓損傷所致的骨質(zhì)疏松也可發(fā)揮神經(jīng)保護作用[12]。

本研究通過細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，四物湯含藥血清組與雌激素組含藥血清作用類似，可促進ROBs的增殖，而四物湯含藥血清的促細胞增殖作用在加入GPER激動劑G1后進一步增強，加入抑制劑G15可被減弱。有研究表明，G15對GPER具有高親和力而對經(jīng)典ER結(jié)合力很弱[13]。本實驗中G15能夠抑制四物湯含藥血清的效應(yīng)，這表明在經(jīng)典雌激素受體途徑之外，四物湯含藥血清可通過非核途徑來發(fā)揮雌激素樣效應(yīng)，即GPER是四物湯含藥血清發(fā)揮促細胞增殖效應(yīng)的重要途徑和作用靶點。細胞免疫熒光實驗表明，與雌激素組含藥血清作用類似，在四物湯含藥血清作用下，ROBs細胞中PI3K、p-Akt的表達量增強，而四物湯含藥血清的這種增強作用也可在加入G1后進一步增強，加入G15明顯減弱。該結(jié)果進一步說明，四物湯含藥血清可通過非核途徑，即GPER信號途徑發(fā)揮雌激素樣作用，且該效應(yīng)是通過影響下游的PI3K/AKT信號通路中相關(guān)調(diào)控因子的活化和表達實現(xiàn)的。PI3K/AKT信號通路，即磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶通路，是經(jīng)典的抗凋亡信號通路之一，有促進細胞周期增殖、調(diào)節(jié)細胞生長等作用[14]。所以影響該信號通路的效應(yīng)也是四物湯調(diào)控細胞增殖活性的重要途徑和機制。

有調(diào)查研究表明，我國女性有50%以上會發(fā)生絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，絕經(jīng)后5-10年是集中發(fā)病時段[15]。婦女在絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平下降，雌激素缺乏使骨的吸收與形成失衡，破骨細胞性骨吸收超過成骨細胞性骨形成，使骨量減少，骨密度下降，骨脆性增加，易發(fā)生骨折[16]。而傳統(tǒng)的雌激素替代療法的臨床療效有一定爭議，增加乳腺癌等腫瘤疾病的發(fā)生風險[17]。四物湯作為婦科補血調(diào)經(jīng)的經(jīng)典方劑，本實驗證明其能通過GPER途徑發(fā)揮雌激素樣作用，對成骨細胞的成熟和骨化有促進作用，可為其治療女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 盧迪,趙丕文,陳夢.基于ER亞型特異性介導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用的四物湯雌激素樣效應(yīng)及其機制的研究.第十四次中國中西醫(yī)結(jié)合實驗醫(yī)學學術(shù)研討會論文匯編,2017:36-45.

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