基于UPLC-TQ MS的丹七軟膠囊中8種活性成分的溶出度考察

龐 穎，楊 健，高 峰＊

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院 北京 100091;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

丹七軟膠囊功效為，活血化瘀，通脈止痛。用于瘀血閉阻所致的血瘀證和胸痹，癥見(jiàn)胸部刺痛、痛處固定、眩暈頭痛、經(jīng)期腹痛[1-5]。主要由丹參、三七提取物組成。丹參的主要活性成分為酚酸類及丹參酮類物質(zhì)；而三七的主要活性成分為三七皂苷。中藥具有多組分作用于多靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)中藥整體作用的特點(diǎn)，不同性質(zhì)的活性成分溶出可能不具有同步性[6-8]。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用作為一種高效互補(bǔ)的分離鑒定技術(shù)，具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)因而得到廣泛應(yīng)用。三重四極桿質(zhì)譜儀的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Multiple reaction monitoring，MRM）可以對(duì)選定的特異離子對(duì)進(jìn)行質(zhì)譜信號(hào)的采集，通過(guò)兩級(jí)離子選擇，排除大量干擾離子，使質(zhì)譜的化學(xué)背景降低，大大的提高了定量分析中的靈敏度、重現(xiàn)性與準(zhǔn)確度[9,10]。本文采用快速、高靈敏度、高選擇性的UPLC-TQ MS技術(shù)，同時(shí)考察丹七軟膠囊中的8種不同類型化合物的溶出規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 儀器

超高效液相色譜儀（UPLC，美國(guó)Waters公司）；串聯(lián)API 5500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Applied Biosystems公司），配備Waters UPLC自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，數(shù)據(jù)采集由Analyst軟件完成。RCZ-8B溶出試驗(yàn)儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 試藥

丹酚酸 B（111562-200202，純度97%），迷迭香酸（111871-201505，純度98%），丹參素（110855-200902，純度98%），三七皂苷R1（110745-200905，純度95%），人參皂苷Rb1（110704-200602，純度94%），人參皂苷Rg1（110703-200405，純度95.0%）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；丹酚酸 A（SH-A0055，純度98.0%），鼠尾草酸（SH-1096746，純度98.0%）購(gòu)自北京萬(wàn)佳首化生物科技有限公司。

表1 UPLC-TQ MS參數(shù)優(yōu)化表

丹七軟膠囊（美納達(dá)）（批號(hào)：15010110、15030113、15050112）由北京長(zhǎng)城制藥廠生產(chǎn)，均購(gòu)自金象大藥房（西單店）。

1.3 色譜條件

不同的目標(biāo)化合物用不同的液相與質(zhì)譜方法檢測(cè)：

丹參酚酸類化合物色譜條件（Meth1）：色譜柱：Waters Acquity HSS T3 column（100×2.1 mm,1.8 μm）；進(jìn)樣量：1 μL；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A.水/甲酸（99.9∶0.1，V/V），B.乙腈（99.9∶0.1，V/V）；洗脫程序?yàn)椋?0-30%B(0-1.5 min)，30-90%B(1.5-2.0 min)，90%B(2.0-3.0 min)，90-20%B(3.0-3.5 min)，20%B(3.5-5.0 min)。

三七皂苷類化合物色譜條件（Meth2）：色譜柱：Waters Acquity HSS T3 column（100×2.1 mm,1.8 μm）；進(jìn)樣量：1 μL；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A.水/甲酸（99.9∶0.1，V/V），B.乙腈（99.9∶0.1，V/V）；洗脫程序?yàn)椋?0-60%B(0-7.0 min)，60-10%B(7.0-7.5 min),10%B(7.5-9.0 min)。

1.4 質(zhì)譜條件

為了提高選擇性和特異性，采用MRM模式進(jìn)行丹七軟膠囊中活性成分的分析。丹參酚酸類成分在Low Mass負(fù)離子模式下檢測(cè)；三七皂苷類成分在High Mass負(fù)離子模式下檢測(cè)。去簇電壓（DP），入口電壓（EP），碰撞能量（CE），碰撞室出口電壓（CXP）等重要參數(shù)都經(jīng)過(guò)較好的優(yōu)化并列于表1中。

1.5 溶出度的條件及測(cè)定

文獻(xiàn)[11]中優(yōu)化了復(fù)方丹參片溶出度研究條件。復(fù)方丹參片中5種活性成分的溶出度比較,參照《中國(guó)藥典》2005年版二部溶出度測(cè)定法第二法進(jìn)行溶出試驗(yàn)。量取900 mL經(jīng)脫氣處理的溶出介質(zhì)（1%SDS水溶液），加熱使介質(zhì)溫度升至并保持于（37±0.5）℃，取6粒丹七軟膠囊（批號(hào)：15010110），每個(gè)轉(zhuǎn)籃中投入1粒，共6個(gè)重復(fù)，轉(zhuǎn)速100 r·min-1進(jìn)行試驗(yàn)，于1、5、10、20、30、45、60、70、90 min定時(shí)、定點(diǎn)取樣2 mL，同時(shí)補(bǔ)加同溫等量的同種介質(zhì)，樣品中加甲醇至4 mL，搖勻過(guò)0.22 μm PTFE濾膜，取續(xù)濾液，UPLC-TQ MS法進(jìn)樣1 μL，測(cè)定目標(biāo)化合物的含量，計(jì)算目標(biāo)物的累積溶出度。

“文明素養(yǎng)”示范。采用推薦和尋訪相結(jié)合的方法，在全市范圍大力實(shí)施“萬(wàn)千百”工程。展示“萬(wàn)家文明風(fēng)”。在全市各主要媒體開(kāi)辟專欄，發(fā)掘、推出家庭文明新事，用凡人小事打動(dòng)人，用身邊事引領(lǐng)身邊人，將發(fā)動(dòng)的過(guò)程變?yōu)樵俳逃倪^(guò)程，以此帶動(dòng)全社會(huì)風(fēng)氣的不斷好轉(zhuǎn)。選樹(shù)“千人公德榜”。在新聞媒體、大型戶外媒體等設(shè)立“千人公德榜”，及時(shí)宣傳弘揚(yáng)社會(huì)公德的典型，匯聚點(diǎn)滴“善小”，形成強(qiáng)大的道德正能量。上好“百堂道德課”。利用“萬(wàn)家文明風(fēng)”展示和“千人公德榜”設(shè)立的契機(jī)，廣泛收集身邊典型人物的典型事跡，使之成為全市道德教育的生動(dòng)教材。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法的建立與優(yōu)化

為了更加準(zhǔn)確快速的檢測(cè)丹七軟膠囊中的活性成分，分別針對(duì)不同性質(zhì)的化合物建立了相應(yīng)的UPLCTQ MS分析條件。丹七軟膠囊內(nèi)容物樣品分析總離子流圖（圖1）中，丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素、鼠尾草酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1及人參皂苷Rg1在相對(duì)應(yīng)的色譜分析條件下的出峰時(shí)間分別為1.28、1.61、1.77、0.84、2.89 min（Meth1）；3.22、4.40、4.81 min（Meth2）。兩種檢測(cè)方法的分析時(shí)間分別為5.0、9.0 min，各檢測(cè)目標(biāo)化合物峰沒(méi)有雜質(zhì)干擾，峰型較好，系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，儀器條件符合要求。

2.2 方法學(xué)確證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密稱定丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹參素，鼠尾草酸，三七皂苷R1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1，50%甲醇超聲波輔助溶解并放冷稀釋，制得上述對(duì)照品濃度分別為0.51、0.60、0.49、0.58、0.35、0.65、0.45、0.59 mg·mL-1貯備液。精密量取一系列體積的貯備液至10 mL量瓶中，加50%甲醇超聲輔助溶解并稀釋至刻度，得到各對(duì)照品系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在相應(yīng)的UPLC-TQ MS分析方法下進(jìn)樣1 μL，記錄色譜峰面積，以對(duì)照品濃度（c）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)做圖，制得各對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 丹七軟膠囊中活性成分的UPLC-TQ MS分析

各目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性良好（r2＞0.9990）。丹酚酸A：Y=585745X+21103（r2=0.9997），丹酚酸 B：Y=1,286,559.81X+607,506.21（r2=0.9998），迷迭香酸：Y=135022X+6.5×107（r2=0.9996），丹參素：Y=232802X+18119（r2=0.9999），鼠尾草酸：Y=1.1×107X+3.5×106（r2=0.9993），三七皂苷R1：Y=6356.3X+21348（r2=0.9992），人參皂苷Rb1：Y=3925.2X+4537（r2=0.9991），人參皂苷Rg1：Y=3852.5X+54761（r2=0.9995）。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

2.2.3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取0.2 g已知含量的軟膠囊內(nèi)容物，共9份，分成3組，分別精密加入高、中、低濃度的對(duì)照品溶液，計(jì)算加樣回收率。如表2顯示，丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹參素，鼠尾草酸，三七皂苷R1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1的回收率分別為101.1、99.5、98.2、98.8、98.4，102.1、101.5、100.1%，RSD 分別為 0.71、0.78、0.66、0.82、0.81、0.91、0.62、0.76%，結(jié)果表明了方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取一定量已知含量的軟膠囊內(nèi)容物，溶解于50%甲醇溶液中，分別在 0、2、4、8、10、12、24 h過(guò)0.22 μmPTFE濾膜后，相應(yīng)的UPLC-TQ MS分析方法進(jìn)樣1 μL，記錄色譜峰面積，穩(wěn)定性由RSD表示。樣品制備24 h內(nèi)，檢測(cè)丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹參素，鼠尾草酸，三七皂苷R1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1 的 RSD 分別為 0.61、0.72、0.57、0.62、0.78、0.84、0.48、0.79%，表明方法在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 丹七軟膠囊累積溶出度曲線

2.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批丹七軟膠囊，取出內(nèi)容物，按文獻(xiàn)中方法分別制備丹七軟膠囊的水溶性及脂溶性供試品溶液各6份，測(cè)定峰面積，由RSD表示重復(fù)性。丹酚酸A，丹酚酸B，迷迭香酸，丹參素，鼠尾草酸，三七皂苷R1，人參皂苷Rb1，人參皂苷Rg1的RSD分別為0.18、0.45、0.38、0.72、0.59、0.79、0.66、0.56%。表明方法的重復(fù)性較好。

2.3 溶出度的測(cè)定

以時(shí)間為橫坐標(biāo)，累積溶出度為縱坐標(biāo)，繪制溶出曲線，結(jié)果如圖2所示。丹七軟膠囊中活性成分特別是水溶性活性成分溶出較快，30 min時(shí)丹參中的丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素、鼠尾草酸等酚酸類成分和三七中的三七皂苷類即可達(dá)到最大的溶出（90%以上），體外溶出較快。

以丹參素和人參皂苷Rg1為指標(biāo)性成分，分別對(duì)丹七軟膠囊的溶出均一性和溶出重現(xiàn)性試驗(yàn)進(jìn)行的考察。取丹七軟膠囊（批號(hào)：15010110）6粒，按所建立的溶出度測(cè)定方法進(jìn)行丹七軟膠囊溶出均一性試驗(yàn)，溶出曲線見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，丹七軟膠囊的溶出均一性良好；取3批丹七軟膠囊樣品（批號(hào)：15010110、15030113、15050112），按所建立的溶出度測(cè)定方法進(jìn)行溶出重現(xiàn)性試驗(yàn)。溶出曲線見(jiàn)圖4，結(jié)果表明3批丹七軟膠囊的溶出重復(fù)性良好。

3 討論

圖3 丹七軟膠囊溶出均一性考察

圖4 丹七軟膠囊溶出重復(fù)性考察

本文建立了基于UPLC-TQ MS的丹七軟膠囊中8種主要活性成分的溶出度的考察方法。包括5個(gè)丹酚酸類物質(zhì)（丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素、鼠尾草酸），3個(gè)三七皂苷類（三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1），且方法的準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性均符合檢測(cè)要求。本研究結(jié)果顯示丹七軟膠囊中活性成分特別是水溶性活性成分溶出較快，30 min時(shí)丹參中的酚酸類成分和三七中的三七皂苷類即可達(dá)到最大的溶出（90%以上）說(shuō)明其體外溶出快，具有溶出均一性。

在一定程度上，體外溶出試驗(yàn)?zāi)軌蝾A(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)的溶出狀況，藥物溶出度的測(cè)定是證明體內(nèi)藥物釋放的一種嚴(yán)謹(jǐn)而有效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法[12-14]。由于中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜、有效成分較多，因此對(duì)其的溶出度研究更為重要。

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