離體豬肝膽道內(nèi)射頻消融時毗鄰膽道熱休克蛋白70表達情況

楊 超，盧 偉，馬軍朋，楊 劍，蔣富強，杜 鵬，張嘉誠，解 鵬，張 哲

惡性膽道梗阻是由膽管癌、胰頭癌、肝癌等惡性腫瘤引起的膽汁引流不暢所致的惡性黃疸。使用雙極射頻消融導(dǎo)管(HabibTMEndoHPB)行膽管內(nèi)消融疏通已堵塞的膽道并植入金屬支架，取得了較長時間的高開通率，同時對膽道支架植入術(shù)后再次堵塞的患者還可再行消融治療[1-5]。作者前期研究證實膽道內(nèi)熱消融時因為膽汁的局部溫度升高，其熱量可能通過膽汁傳遞至毗鄰非消融膽管內(nèi)，但在常規(guī)消融參數(shù)下毗鄰非消融區(qū)膽管未見明顯損傷[6]。熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一組生物體內(nèi)普遍存在、進化上高度保守的蛋白質(zhì)家族，又被稱為分子伴侶。大量資料表明，在應(yīng)激狀態(tài)下HSP70參與細胞的抗損傷、修復(fù)和熱耐受過程，是一種保護性蛋白，受到高溫等惡劣環(huán)境襲擊時，組織就會大量合成[7]。本研究利用免疫組織化學(xué)方法檢測膽管內(nèi)射頻消融后毗鄰膽管HSP70的表達水平，并探討不同消融功率下毗鄰消融靶區(qū)的膽管組織內(nèi)HSP70表達的差異及意義。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物器官：15例健康本地長白豬新鮮離體豬肝，均保留有完整的膽囊及中上段膽總管；②器械：包括經(jīng)皮穿刺式雙極射頻導(dǎo)管HabibTMEndoHPB(英國EMcisio公司)、超滑導(dǎo)絲(0.035 inch，日本Terumo公司)、單彎導(dǎo)管(5Fr，上海Cordis公司)；③儀器：數(shù)字減影血管造影機(digital subtraction angiography，DSA)(AlluraXper FD20,荷蘭Philips公司)，射頻發(fā)生儀(Model 1500X,美國Rita Medical Systems公司)，SP試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；④實驗藥品：對比劑(碘佛醇370)，人膽汁(提前自膽道梗阻患者膽道引流管內(nèi)收集)。

1.2 方法

1.2.1 建立人膽汁充盈離體豬肝膽道系統(tǒng)消融模型 將新鮮離體豬肝放置于DSA手術(shù)臺上，仔細查看確保膽道系統(tǒng)完好無損。使用注射器經(jīng)膽總管緩慢注入提前收集好的人膽汁，在DSA透視下經(jīng)膽總管引入超滑導(dǎo)絲，然后置入5Fr單彎導(dǎo)管，退出導(dǎo)絲后注入碘佛醇造影，證實膽道系統(tǒng)完整無損傷。經(jīng)單彎導(dǎo)管引入導(dǎo)絲后撤出導(dǎo)管，于DSA透視下經(jīng)導(dǎo)絲插入HabibTMEndoHPB射頻消融導(dǎo)管至膽總管上端近肝門區(qū)并用縫線將消融導(dǎo)管與膽總管綁緊，防止膽汁滲漏(圖1)，并連接好射頻發(fā)生儀。

A：射頻消融導(dǎo)管插入新鮮離體豬肝肝門區(qū)膽管內(nèi)；B：經(jīng)消融導(dǎo)管造影證實膽道系統(tǒng)完好

1.2.2 離體豬肝膽管內(nèi)消融及免疫組化染色 15個新鮮離體豬肝隨機分為3組、每組5個，所有豬肝均消融120 s，第1、2、3組分別采用10 W、12 W、14 W功率消融，消融后取距遠端消融電極1 cm、2 cm處膽管組織。鼠抗HSP70單克隆抗體(1∶50)，操作嚴格按照試劑盒說明進行。3，3-二氨基苯聯(lián)胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，采用S-P法對全部標本進行免疫組化染色，染色前使用微波爐進行抗原修復(fù)。用已知陽性組織切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照。

1.2.3 結(jié)果判定 觀察到黃色或棕黃色顆粒時判定為陽性結(jié)果，隨機觀察100個細胞，HSP70的染色結(jié)果(表達強度)分為3級。1級，陽性細胞數(shù)<30%，染色顆粒淺黃、細小、成堆；2級，陽性細胞數(shù)為30%～60%，染色顆粒深黃、粗大、成片；3級，陽性細胞數(shù)>60%，染色顆粒棕黃、粗大、成片[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，分別采用Spearman相關(guān)分析及Wilcoxon秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 消融模型建立 本研究中，人膽汁充盈離體豬肝膽道系統(tǒng)消融模型均成功建立(圖1A、B)。15例豬肝共30例膽管組織HSP70表達強度記錄見表1。

2.2 膽管組織HSP70表達強度 消融區(qū)域膽管壁大體肉眼觀呈灰黃色至深黃色改變，管壁周圍可見膽汁滲入膽管壁，毗鄰膽管壁未見明顯變化(圖2)。距遠端消融電極1 cm處膽管組織HSP70表達強度：1級染色4例(26.7%)，2級染色6例(40%)，3級染色5例(33.3%)；距遠端消融電極2 cm處膽管組織HSP70表達：1級染色10例(66.7%)，2級染色4例(26.7%)，3級染色1例(6.6%)。不同消融功率與HSP70表達強度結(jié)果見表1。

表1 消融功率與HSP70表達強度

消融功率越高，消融區(qū)毗鄰膽管(距遠端消融電極1 cm)HSP70表達強度越強，兩者呈明顯正相關(guān)(r=0.755，P<0.001)；距遠端消融電極1 cm處膽管組織HSP70表達強于距遠端消融電極2 cm處的表達(Z=-2.334,P<0.05，表2)，越靠近消融區(qū)域的膽管越可能受到消融熱量的影響損傷，從而HSP70大量快速表達以修復(fù)熱損傷(圖3)。

使用14 W功率消融120 s后消融區(qū)膽管壁深黃色，膽汁滲入肝組織；距消融區(qū)1、2 cm處膽管壁顏色未見明顯變化

表2 取材位置與HSP70表達強度

注：Z=-2.334,P<0.05

使用14 W功率消融120 s后取距消融區(qū)1 cm處膽管組織行免疫組化檢測，可見多數(shù)膽管上皮細胞核及胞漿中出現(xiàn)深黃色顆粒，HSP70表達強度判定為2級(HE染色，×400)

3 討論

近年來膽管內(nèi)射頻消融治療惡性膽道梗阻已逐漸應(yīng)用于臨床，并取得了較滿意的療效[5，8-9]。作者前期研究證實膽管內(nèi)射頻消融所產(chǎn)生的熱量會經(jīng)膽管內(nèi)膽汁傳遞至毗鄰消融區(qū)的正常膽管，病理切片證實不會損傷正常膽管及毗鄰肝組織。大量資料表明，組織在應(yīng)激狀態(tài)下HSP參與細胞的抗損傷、修復(fù)和熱耐受過程，是一種保護性蛋白，受到高溫等惡劣環(huán)境襲擊時，組織就會大量合成[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)膽管內(nèi)射頻消融后，毗鄰消融區(qū)的膽管組織出現(xiàn)HSP70的表達，且表達強度與消融功率呈正相關(guān)。說明膽管內(nèi)射頻消融時，產(chǎn)生的熱量會使毗鄰正常膽管組織出現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)，合成HSP70以抗熱損傷并進行修復(fù)。隨著功率的增加，熱量經(jīng)膽汁傳遞至鄰近組織增多，誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70不足以抵抗熱損傷時，毗鄰消融區(qū)的正常膽管則可能首先出現(xiàn)可逆性的熱損傷，如組織出血、水腫等炎性反應(yīng)。當消融功率及消融時間繼續(xù)增加時，毗鄰消融區(qū)的正常膽道則可能出現(xiàn)不可逆的熱損傷，從而造成毗鄰正常膽道狹窄、攣縮或膽瘺等并發(fā)癥。

據(jù)文獻報道,HSP70在腫瘤免疫中亦發(fā)揮重要作用,HSP70不僅參與腫瘤抗原的加工呈遞,而且可作為抗原呈遞分子直接將腫瘤抗原肽呈遞給T細胞,激發(fā)T細胞介導(dǎo)的特異腫瘤細胞免疫[13-15]。因此，當進行膽道內(nèi)射頻消融治療惡性膽道梗阻，且未出現(xiàn)毗鄰膽管組織不可逆性熱損傷時，其所產(chǎn)生的HSP70不僅可以抵抗射頻消融所產(chǎn)生熱量經(jīng)膽汁傳遞造成的熱損傷，并且可能對腫瘤免疫發(fā)揮一定作用。

總之，本研究結(jié)果表明，膽管內(nèi)射頻消融可導(dǎo)致消融區(qū)毗鄰膽管組織HSP70表達，遠離消融區(qū)域膽管(距離遠端消融電極≥2 cm)HSP70表達無明顯增多；隨著消融功率的增加，毗鄰消融區(qū)膽管組織內(nèi)HSP70表達強度亦隨之增加。因此，在目前臨床常規(guī)應(yīng)用消融參數(shù)下，經(jīng)皮肝穿膽管內(nèi)射頻消融對消融區(qū)毗鄰正常膽管組織是安全可靠的，但隨著消融功率的增加則可能對毗鄰正常膽管產(chǎn)生熱損傷。本研究使用新鮮離體豬肝，膽囊及中上段膽總管內(nèi)的膽汁是不流動的，后續(xù)可在此研究基礎(chǔ)上建立活體動物實驗?zāi)Ｐ?，從而更為準確模擬臨床實際、評估膽道內(nèi)射頻消融后毗鄰正常膽管損傷情況。

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