前列腺癌患者癌組織中miR-21表達(dá)水平及與預(yù)后的關(guān)系分析

楊秋香，鄧 實(shí)，郭良芳，楊清榮

近年，前列腺癌發(fā)病率已高居我國男性泌尿系統(tǒng)疾病首位，內(nèi)分泌治療和根治性手術(shù)是該惡性腫瘤主要治療方式，但兩種方式皆可因治療后癌灶轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)導(dǎo)致治療失敗，故探索前列腺癌發(fā)病機(jī)制，尋找指示前列腺癌預(yù)后的標(biāo)志物十分必要[1-3]。此前，國際上將前列腺特異抗原(prostate-specific antigen，PSA)>4 ng/mL作為前列腺癌篩查指標(biāo)，但臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PSA值處于4～10 ng/mL時(shí)，難以區(qū)分前列腺良惡性病變，PSA診斷的特異性、敏感性并不夠理想[4-5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,microRNA)為腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供新思路，microRNA為18～26個(gè)堿基大小的非編碼單鏈RNA，可對靶基因發(fā)揮調(diào)控作用，參與人類癌癥發(fā)生發(fā)展過程[6]。microRNA-21(miR-21)屬于microRNA家族成員之一，目前發(fā)現(xiàn)，其在肺癌、甲狀腺乳頭狀癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種癌組織中表達(dá)異?，F(xiàn)象[7]。作者通過特異性TaqMan探針實(shí)時(shí)定量PCR法探討miR-21在前列腺癌患者癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析其與患者臨床預(yù)后的關(guān)系，為前列腺癌診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料 選取2011年1月—2012年6月四川大學(xué)華西醫(yī)院76例行前列腺癌手術(shù)切除患者資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床診斷符合世界衛(wèi)生組織有關(guān)前列腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，均行前列腺癌根治性手術(shù)治療，每例術(shù)中均獲得2份前列腺組織，術(shù)后病理檢測確定為1份屬于前列腺癌灶組織，1份屬于癌旁正常前列腺組織；②術(shù)前均未接受放化療、內(nèi)分泌治療等保守方式治療者；③相關(guān)病理資料及隨訪資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者；②復(fù)發(fā)性前列腺癌者；③術(shù)后接受放化療等方式治療者；④合并急性感染、高血壓、糖尿病、肺結(jié)核、風(fēng)濕病等其他疾病者。76例患者均為男性，年齡47～75(58.89±6.74)歲。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 從-80 ℃冰箱取出經(jīng)病理切片證實(shí)為前列腺癌癌組織和癌旁正常前列腺組織的標(biāo)本2～3 mm3，冷凍勻漿后加入1 mL TRIzol試劑(購自美國Invitrogen公司)，遵照說明書提取總RNA，再使用20 μL焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)水(購自美國Ameresco公司)溶解提取總RNA；總RNA提取完畢后，采用NanoVue分光光度計(jì)(購自美國GE公司)檢驗(yàn)獲得RNA樣品純度和質(zhì)量，吸光度處于1.8～2.0之間為達(dá)標(biāo)樣品，進(jìn)行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 取一個(gè)200 μL去RNA酶微量離心管(Eppendorf，EP)(購自美國Invitrogen公司)，依次加入5 μL RNA(總RNA量最多5 μg)、2 μL microRNA特異性引物(5×)、1 μL 10 mM dNTP Mix、2 μL DEPC水，總量10 μL，標(biāo)記為Mix1；另取一個(gè)50 μL去RNA酶EP管，依次加入2 μL 10×RT反轉(zhuǎn)錄緩沖液、4 μL 25 mM鎂離子、2 μL 0.1M dTT、1 μL RNaseout 40 u/μL、1 μL SuperScrip RT(200 U/μL)和Mix1，共20 μL反應(yīng)液，置入聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀(德國Eppendorf公司)，調(diào)試程序?yàn)?6 ℃處理30 min、50 ℃處理30 min、85 ℃處理5 min，反應(yīng)后獲得cDNA模板，試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增檢測 miR-21表達(dá)量采用特異性TaqMan探針RT-PCR進(jìn)行檢測，miR-21引物和探針由美國Invitrogen公司設(shè)計(jì)(引物序列為其專利，不提供具體堿基序列)，U6作為內(nèi)參基因，miR堿基序列為：5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′。準(zhǔn)備8 μL超純水、1 μL特異性引物(20×)、10 μL PCR Master Mix、1 μL cDNA模板，總體系20 μL，置于RT-PCT儀。設(shè)置如下反應(yīng)步驟：①95 ℃，120 s；②95 ℃保持10 s退火，60 ℃保持30 s延伸。進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。儀器軟件獲得CT值，經(jīng)2-△△CT[9]計(jì)算miR-21在前列腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo) ①分析miR-21在前列腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況；②以前列腺癌患者癌灶組織與癌旁正常組織miR-21表達(dá)量比值為2作為臨界值[10]，將患者分為miR-21高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析表達(dá)量與臨床病理的關(guān)系；③采用Kaplan-Meier生存曲線分析miR-21表達(dá)量與患者生存的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 miR-21在前列腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)分析 實(shí)時(shí)定量PCR分析76份前列腺癌組織和76份癌旁正常前列腺組織miR-21相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，miR-21在前列腺癌組織中相對表達(dá)量為(2.68±0.54)，明顯高于癌旁組織的(1.14±0.42)(t=19.62，P<0.05)，圖1，說明miR-21在前列腺癌患者癌組織中具有高表達(dá)現(xiàn)象，提示miR-21對前列腺癌具有診斷價(jià)值。

圖1 miR-21在前列腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)分析

2.2 miR-21與前列腺癌患者病理特征的關(guān)系分析前列腺癌患者miR-21高表達(dá)者57例(75%)，低表達(dá)者19例(25%)。2組TNM分期(χ2=9.444，P=0.002)、Gleason評分(χ2=5.197，P=0.023)、18個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移比較(χ2=10.321，P=0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而年齡(χ2=0.439，P=0.508)、前列腺體積(χ2=0.179，P=0.672)、血清PSA水平比較(χ2=0.441，P=0.506)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表1。

表1 miR-21與前列腺癌患者病理特征的關(guān)系分析

2.3 前列腺癌患者miR-21表達(dá)量與預(yù)后 miR-21表達(dá)量低組平均生存期32.5個(gè)月，miR-21表達(dá)量高組平均生存期24.8個(gè)月，經(jīng)Kaplan-Meier生存分析顯示，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)，圖2。

圖2 前列腺癌患者組織miR-21表達(dá)量與生存的關(guān)系分析

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)microRNA在癌癥發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，不斷扮演著抑癌基因或原癌基因角色，且不同癌癥microRNA表達(dá)譜并不相同[11-12]。miR-21屬于microRNA大家族中的一種，長約18～24 bp，被發(fā)現(xiàn)時(shí)間較早，能夠特異性識別并結(jié)合mRNA 3′非翻譯區(qū)，發(fā)揮抑制或降解靶mRNA，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，多表達(dá)于人體細(xì)胞和組織中，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、調(diào)控癌癥等過程。目前研究顯示，其在多種癌癥組織中具有過量表達(dá)趨勢，如肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等，但有關(guān)前列腺癌相關(guān)的研究相對較少[13]。本研究檢測miR-21在前列腺癌患者癌組織中表達(dá)情況，并分析其與患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-21在前列腺癌患者癌組織中具有高表達(dá)現(xiàn)象，且表達(dá)情況與前列腺癌患者TNM分期、Gleason評分、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和生存期均有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，大約50%的microRNA定位于癌癥基因組位置，通過調(diào)控多種靶基因發(fā)揮抑癌或原癌基因作用，而miR-21主要定位于染色體17q23.2位置，位于常見FRA17B斷裂位點(diǎn)內(nèi)，此位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)是肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌過量擴(kuò)增位點(diǎn)，且與人類TMEM49基因發(fā)生部分重疊編碼，故miR-21在此位點(diǎn)上調(diào)表達(dá)，可導(dǎo)致癌癥發(fā)生[14]。本研究miR-21在前列腺癌組織中高表達(dá)，證明其在前列腺癌中表達(dá)情況與多種癌癥類型過表達(dá)一致，miR-21與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。張聰?shù)萚15]分析miR-21在前列腺癌組織和良性前列腺增生組織中表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-21在前列腺癌組織中表達(dá)水平高于良性前列腺增生組織，認(rèn)為miR-21參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，與本研究論點(diǎn)一致。此外，miR-21還參與雄激素非依賴性前列腺癌進(jìn)展，主要與miR-21能夠在轉(zhuǎn)錄過程直接調(diào)控前列腺癌雄激素受體表達(dá)，促進(jìn)雄激素分泌，進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞不斷增殖有關(guān)[16]。

miR-21不僅可在前列腺癌組織中高表達(dá)，而且與前列腺癌手術(shù)治療患者預(yù)后療效密切相關(guān)。miR-21高表達(dá)組的TNM分期多為Ⅲ～Ⅳ期，Gleason評分≥7分，18個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，生存期短，且與低表達(dá)組差異顯著，說明miR-21表達(dá)與前列腺癌進(jìn)展程度、組織學(xué)分級、癌灶復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和生存期密切相關(guān)。腫瘤TNM分期越高，Gleason評分越高，預(yù)示腫瘤惡性程度越高，即便給予根治性手術(shù)切除，仍有較高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，降低生存期；而miR-21表達(dá)則可指示患者預(yù)后，能夠?yàn)楹笃谳o助治療方案的制定提供參考，提高治療成功率。目前有關(guān)miR-21表達(dá)與前列腺癌治療預(yù)后的報(bào)道并不多，僅張聰?shù)萚15]證實(shí)，miR-21與前列腺癌手術(shù)治療患者術(shù)前Gleason評分相關(guān)。抑制腫瘤細(xì)胞miR-21表達(dá)，其細(xì)胞核內(nèi)AR、AKT、mTOR等蛋白均呈下調(diào)表達(dá)趨勢，可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，故miR-21有望成為前列腺癌新的基因治療靶點(diǎn)。

總之，miR-21在前列腺癌組織中高表達(dá)，可能參與該癌癥的發(fā)生發(fā)展過程，miR-21表達(dá)與前列腺癌手術(shù)治療患者的TNM分期、Gleason評分、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和生存期密切相關(guān)，說明其可指示預(yù)后療效。但臨床應(yīng)用組織學(xué)標(biāo)本檢驗(yàn)miR-21表達(dá)情況，受限于樣本取樣，并不適于廣泛推廣，后期還需探究血清miR-21水平在前列腺癌患者中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系，及分析miR-21如何影響前列腺癌的生物調(diào)節(jié)機(jī)制，方可利于抗癌技術(shù)發(fā)展，任重而道遠(yuǎn)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Chuang KY,Chuang YC,Ho YS.Global influence of cancer statistics articles[J].Curr Sci,2015,109(9):1552-1554.

[2]郭瓊,嚴(yán)彬,南小新,等.miRNA-29b在前列腺癌中的表達(dá)及意義[J].醫(yī)學(xué)臨床研究,2015,32(1):42-44.

[3]張永生,張立平,劉西林,等.快速免疫組化技術(shù)在前列腺穿刺組織冰凍切片診斷中的應(yīng)用[J].中國基層醫(yī)藥,2015,22(11):1700-1703.

[4]Kotb S,Mosharafa A,Essawi M,et al.Circulating miRNAs 21 and 221 as biomarkers for early diagnosis of prostate cancer[J].Tumor Biol,2014,35(12):12613-12617.

[5]Guo YF,Li FH,Xie SW,et al.Value of contrast-enhanced sonographic micro flow imaging for prostate cancer detection with t-PSA level of 4-10 ng/mL[J].Eur J Radiol,2012,81(11):3067-3071.

[6]Garzon R,Fabbri M,Cimmino A,et al.MicroRNA expression and function in cancer[J].Trends Mol Med,2006,12(12):580-587.

[7]Ohno R,Uozaki H,Kikuchi Y,et al.Both cancerous miR-21 and stromal miR-21 in urothelial carcinoma are related to tumour progression[J].Histopathology,2016,69(6):993-999.

[8]《臨床泌尿外科雜志》編輯部.歐洲泌尿?qū)W會更新前列腺癌診療指南[J].臨床泌尿外科雜志,2006,21(5):399-400.

[9]Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CT method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[10]劉風(fēng)林,王新鋒,王興武,等.非小細(xì)胞肺癌組織miRNA-21表達(dá)及預(yù)后相關(guān)性研究[J].中華腫瘤防治雜志,2012,19(18):1397-1399.

[11]單保恩,劉麗華.MicroRNA:癌癥診治新靶點(diǎn)[J].中國腫瘤生物治療雜志,2014,21(6):603-609.

[12]劉田.microRNA在甲狀腺癌中的研究進(jìn)展[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014,39(3):417-419.

[13]Shibuya H,Iinuma H,Shimada R,et al.Clinicopathological and prognostic value of microRNA-21 and microRNA-155 in colorectal cancer[J].Oncology,2010,79(3/4):313.

[14]Abue M,Yokoyama M,Shibuya R,et al.Circulating miR-483-3p and miR-21 is highly expressed in plasma of pancreatic cancer[J].Int J Oncol,2015,46(2):539-547.

[15]張聰,曹立宇,尹玉,等.前列腺癌組織中miR-21的表達(dá)及臨床意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2016,32(12):1365-1367.

[16]Ribas J,Lupold SE.The transcriptional regulation of miR-21,its multiple transcripts and their implication in prostate cancer[J].Cell Cycle,2010,9(5):923-929.