基于PTEN的康萊特誘導(dǎo)人胰腺癌細胞凋亡作用

劉穎　孫學(xué)佳　肖銦　劉適　趙晶　秦偉

[摘要] 目的 研究康萊特注射液分別在PTEN正常表達和低表達時對人胰腺癌細胞凋亡的影響，進而評估康萊特注射液對胰腺癌的治療作用。方法 該研究于2016年2月—2017年9月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院進行，人胰腺癌PANC-1細胞、沉默PTEN表達的胰腺癌PANC-1細胞分別分成康萊特處理組及未處理組，以流式細胞術(shù)檢驗胰腺癌細胞凋亡改變。結(jié)果 康萊特處理組胰腺癌細胞凋亡率（59.67±13.23）%明顯高于對照組（13.26±4.72）%（P<0.01），shPTEN+康萊特組和shPTEN組細胞凋亡率（39.85±13.47）%和（27.37±8.62）%也高于對照組（13.26±4.72）（P<0.05）。 結(jié)論 康萊特注射液以調(diào)控PTEN 表達的方式誘導(dǎo)人胰腺癌細胞凋亡，康萊特注射液是一種治療胰腺癌的潛力藥物。

[關(guān)鍵詞] 胰腺癌；康萊特；PTEN

[中圖分類號] R4 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）02（c）-0023-03

PTEN - based Kanglaite Induces Apoptosis in Human Pancreatic Cancer Cells

LIU Yin1， SUN Xue-jia2， XIAO Yin1， LIU Shi3， ZHAO Jing3， QIN Wei4

1.Oncology Department， Third Hospital of Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161099 China； 2. Radiology Department， Third Hospital of Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161099 China； 3. General Surgery Department， Third Hospital of Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161099 China； 4. Academic Affairs Office， Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161099 China

[Abstract] Objective This paper tries to study the effect of Kanglaite Injection on the apoptosis of human pancreatic cancer cells in normal and low expression of PTEN， and to evaluate the therapeutic effect of Kanglaite injection on pancreatic cancer. Methods This study was carried out in Harbin Medical University School of Public Health from February 2016 to September 2017 Pancreatic cancer PANC-1 cells and PTEN-expressing pancreatic cancer PANC-1 cells were divided into Kanglaite treatment group and untreated group respectively. The apoptosis of pancreatic cancer cells was examined by flow cytometry. Results The apoptosis rate of pancreatic cancer cells in KLT group（59.67±13.23）% was significantly higher than that in control group （13.26±4.72）%（P<0.01）. The apoptotic rates of shPTEN + KLT group and shPTEN group （39.85±13.47）% and （27.37±8.62）% was also higher than the control group（13.26±4.72）%（P<0.05）. Conclusion Kanglaite injection induces apoptosis of human pancreatic cancer cells by regulating PTEN expression. Kanglaite injection is a potential drug for pancreatic cancer.

[Key words] Pancreatic cancer； Kanglaite； PTEN

胰腺癌是惡性程度最高的癌癥之一，患者的5年生存率小于5%[1]，它的發(fā)病率有逐年升高的趨勢，而現(xiàn)有的治療措施效果差強人意，故而越來越多的新藥物抗胰腺癌的相關(guān)研究在全球范圍開展起來?？等R特注射液的主要成分是中藥薏苡仁油[2]， 它在中國主要用于非小細胞肺癌、肝癌以及胃癌的輔助治療[3-5]，它能以多種機制作用于多種信號通路或靶點發(fā)揮抗癌作用[2-4，6-11]，但是它抗胰腺癌的作用及機制卻鮮有研究。PTEN是PI3K/Akt/mTOR通路的一個重要調(diào)控因子，也是一個非常重要的抑癌基因。該研究起始于2016年2月—2017年9月，該研究實驗重復(fù)3次，該研究通過觀察經(jīng)康萊特注射液分別在PTEN正常表達或低表達時對人胰腺癌細胞凋亡的影響，初步闡釋了康萊特注射液抗胰腺癌的機制，并將為康萊特注射液治療胰腺癌的早日臨床應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 PTEN基因沉默

人胰腺癌PANC-1細胞購于中科院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所，以慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法沉默PANC-1細胞PTEN的表達。首先將含熒光素酶和PTEN的shRNA分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入人胰腺癌PANC-1細胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)24 h后更換培養(yǎng)基，隨后在轉(zhuǎn)導(dǎo)后的第36、48、60、72 h獲取上清液，并將獲得的上清液過濾、離心及重懸浮，最后把含有shLuc或shPTEN的慢病毒顆粒以適當(dāng)濃度轉(zhuǎn)導(dǎo)入人胰腺癌PANC-1細胞。用Western blot法檢驗PTEN基因沉默的效果。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基分別培養(yǎng)PTEN正常表達和低表達的PANC-1細胞，首先用10 μL/mL的康萊特注射液或去離子水處理細胞48 h，以流式細胞術(shù)檢驗胰腺癌細胞凋亡改變。

1.3 細胞凋亡檢測

把收獲、洗滌后的PTEN正常表達和低表達的人胰腺癌PANC-1細胞分別加入10 μL異硫氰酸熒光素和10 μL碘化丙啶，隨后在暗室中室溫下培育10 min，然后用FACSCalibur流式細胞儀分析染色后的細胞，其中右下象限標(biāo)示為早期凋亡細胞，右上象限標(biāo)示為晚期凋亡細胞。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理實驗數(shù)據(jù)，數(shù)值采用均數(shù)±標(biāo)準差（x±s）表示，t檢驗，3組及以上數(shù)值間差異采用單因素方差分析檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果表明，將PTEN正常表達和低表達PANC-1細胞用10 μL/mL的康萊特注射液或去離子水分別處理48 h后，康萊特處理組細胞凋亡率明顯高于對照組 （P<0.01）， shPTEN+康萊特組和shPTEN組細胞凋亡率也高于對照組 （P<0.05），詳見圖1。該研究結(jié)果證實康萊特處理組胰腺癌細胞凋亡率（59.67±13.23）%明顯高于對照組（13.26±4.72）%（P<0.01），并且康萊特組細胞PTEN表達顯著高于對照組（P<0.01），shPTEN組、shPTEN+康萊特組細胞凋亡率高于對照組（P<0.05）。

3 討論

上述實驗結(jié)果證實在康萊特注射液誘導(dǎo)人胰腺癌細胞凋亡的過程中PTEN起到了關(guān)鍵性作用，而敲低PTEN基因的表達水平能夠減弱康萊特注射液誘導(dǎo)人胰腺癌細胞凋亡的作用。鮑英等人[12]的研究表明經(jīng)20 μl/mL康萊特作用胰腺癌8988細胞72 h 后， 經(jīng)TUN EL染色檢測凋亡細胞比例為11.84%，而對照組為3.24 %，該實驗結(jié)果與該研究的差異可能由于實驗方法、細胞株及沒進行多次實驗所致的實驗誤差引起的。

PTEN基因是PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵的抑制因子之一，它的缺失或者失活都能夠引起PI3K/Akt/mTOR通路的活化。PI3K/Akt/mTOR通路的激活能加速腫瘤組織血管生成，促使腫瘤細胞增殖、增強腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移能力，與此同時可以抑制腫瘤細胞凋亡 [13]。PTEN是PI3K/Akt/mTOR通路的一個重要調(diào)控因子，也是一個非常重要的抑癌基因。提高PTEN 基因的表達水平是康萊特注射液對PI3K/Akt/mTOR 信號通路的抑制作用機制之一， PTEN基因表達水平的降低可以在一定范圍內(nèi)減弱康萊特注射液對PI3K/Akt/mTOR 信號通路的抑制作用?？等R特注射液誘導(dǎo)人胰腺癌細胞增殖凋亡作用的發(fā)揮在一定程度上是通過借助PTEN調(diào)控此通路實現(xiàn)的。

該研究在國際上首次研究了康萊特注射液誘導(dǎo)人胰腺癌細胞凋亡的作用與PTEN基因的關(guān)系，初步揭示了康萊特注射液抗胰腺癌作用的機制，將為康萊特注射液治療胰腺癌的早日臨床應(yīng)用提供理論支持。

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（收稿日期：2017-11-28）