氮源對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量及藥效物質(zhì)產(chǎn)量影響的研究

李園園，楊 帆，姜美娜，許舒文，寇嘉賓，劉麗麗

（天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

人工栽培蛹蟲草可增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益，蛹蟲草因其含有極高的藥用價(jià)值，其產(chǎn)量的增加要比一般農(nóng)作物的產(chǎn)量增加帶來更高的經(jīng)濟(jì)效益。蛹蟲草中含有豐富的藥效物質(zhì)成分，其藥效物質(zhì)生物活性成分與天然冬蟲夏草相似，而成為冬蟲夏草最常用的替代品。研究表明，蛹蟲草的生物活性成分主要有腺苷、蟲草素、蟲草多糖和蟲草酸等。腺苷具有改善心腦血液循環(huán)、松弛血管平滑肌、防止心率失常等生理活性，是深層大腦刺激效果的關(guān)鍵，可用來治療帕金森癥和有嚴(yán)重震顫患者[1]。蟲草素具有抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑菌與抗炎作用等作用[2]。蟲草多糖是蟲草中最重要、最豐富的藥理活性物質(zhì)，有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂等功效[3]。蟲草酸，即D-甘露醇，現(xiàn)已被認(rèn)為是發(fā)酵蟲草菌絲體中活性成分的重要測(cè)試指標(biāo)之一，具有利尿脫水、提高血漿滲透壓、鎮(zhèn)喘祛痰、抗自由基等藥理作用[4]。本試驗(yàn)通過不同培養(yǎng)基培養(yǎng)蛹蟲草，篩選出生產(chǎn)藥效物質(zhì)含量最高的蛹蟲草的培養(yǎng)條件，以期為大規(guī)模液體發(fā)酵用于農(nóng)業(yè)栽培提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 蛹蟲草菌種，由天津師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

腺苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）購于天津泰艾瑞科技有限公司；甲醇（色譜純）、蒽酮（分析純）、硫酸（分析純）、高碘酸鈉（分析純）、醋酸銨（分析純），均購于天津瑞博星科技有限公司；蒸餾水、超純水。

1.1.2 栽培基質(zhì) PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

循環(huán)水式真空泵SHD-D（Ⅲ），鞏義市予華儀器有限公司；高效液相色譜儀Waters Alliance 2695，美國Waters公司；醫(yī)用超凈工作臺(tái) SW-CJ-IF，蘇州安泰技術(shù)有限公司、超純水機(jī)UItra CLEAR，德國SG公司；紫外可見分光光度計(jì) UA 2550，Shimadzu。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)量測(cè)定方法 取生長至30 d的蛹蟲草菌絲體，3 000 r·min-1離心6 min，去除上清液，置于60 ℃烘箱中烘干，測(cè)干重并記錄。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的制備：分別準(zhǔn)確稱取腺苷、蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品各4 mg，溶入10 mL超純水中，制得400 μg·mL-1的腺苷、蟲草素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。吸取腺苷、蟲草素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，分別制得濃度為1、5、10、15、20、25、30 和 35 μg·mL-1的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

蟲草多糖標(biāo)準(zhǔn)品的制備：稱取10 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，溶于10 mL蒸餾水中，制得1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，備用。吸取1 mL葡萄糖儲(chǔ)備液用蒸餾水稀釋至10 mL，得0.1 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 的 0.1 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，分別加蒸餾水至1 mL，制得蟲草多糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

蟲草酸標(biāo)準(zhǔn)品的制備：稱取10 mg甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品，溶于10 mL蒸餾水中，制得1 mg·mL-1的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，備用。吸取1 mL甘露醇儲(chǔ)備液用蒸餾水稀釋至10 mL，得0.1 mg·mL-1的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 的 0.1 mg·mL-1甘露醇標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，分別加蒸餾水至1 mL，制得蟲草多糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取烘干的蛹蟲草菌絲體，研磨成粉末狀。稱取0.01 g蛹蟲草菌絲體粉于1.5 mL離心管中，加入1 mL超純水，超聲提取15 min，3 000 r·min-1離心6 min，吸取上清液即為供試品溶液。

1.2.4 藥效物質(zhì)產(chǎn)量測(cè)定方法 腺苷和蟲草素用高效液相色譜測(cè)定，色譜條件為：Waters C18柱；流動(dòng)相：甲醇-水（15∶85）；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長為260 nm; 柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL, 流速 1 mL·min-1。

蟲草多糖用蒽酮硫酸法測(cè)定，即取1 mL待測(cè)溶液于試管中，加入4 mL蒽酮硫酸溶液（0.2 g蒽酮溶于100 mL 80%濃H2SO4），搖勻，沸水浴10 min，取出迅速冷卻至室溫，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在625 nm 處的OD值，對(duì)照品為蒸餾水代替待測(cè)品溶液做同樣的操作。

蟲草酸的測(cè)定用高碘酸鉀比色法[4],取1 mL的待測(cè)溶液于試管中，加入1 mL高碘酸鉀溶液，搖勻，室溫反應(yīng)10 min，加入2 mL 0.1%的L-鼠李糖溶液，搖勻，除去多余的高碘酸鉀，然后加入4 mL 新配置的Nash試劑，放入53 ℃恒溫水浴中15 min，使其呈色，之后迅速冷卻至室溫，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在412 nm 處的OD值，對(duì)照品為蒸餾水代替待測(cè)品溶液做同樣的操作。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草產(chǎn)量測(cè)定

蠶蛹粉中因含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，而成為蛹蟲草栽培過程中常用的添加物，本試驗(yàn)以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加5%、10%和15%的蠶蛹粉浸提液為蛹蟲草的栽培基質(zhì)，對(duì)照為PDA培養(yǎng)基不添加蠶蛹粉浸提液，栽培培養(yǎng)蛹蟲草，并測(cè)量蛹蟲草的產(chǎn)量，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 氮源對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量的影響

由表1可知，栽培基質(zhì)里添加蠶蛹粉浸提液確實(shí)能提高蛹蟲草的產(chǎn)量，而且隨著添加量的增加蛹蟲草的產(chǎn)量呈先增加后減少的趨勢(shì)，分析原因可能是蠶蛹粉浸提液比較粘稠，當(dāng)其量達(dá)到一定程度時(shí)，會(huì)影響栽培基質(zhì)的透氣性，從而影響蛹蟲草的產(chǎn)量。當(dāng)栽培基質(zhì)里蠶蛹粉浸提液的添加量為10%時(shí)，蛹蟲草的產(chǎn)量最高，且顯著高于其他各組，因此選擇PDA培養(yǎng)基添加10%蠶蛹粉浸提液為獲得蛹蟲草產(chǎn)量最大的最佳培養(yǎng)條件。

2.2 蛹蟲草藥效物質(zhì)產(chǎn)量的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取腺苷和蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照1.2.4色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線：

y=75 674x+7 648.6，R2=0.999 9；

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線：

y=87 031x+19 455，R2=0.999 2。

取已制好的蟲草多糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.2.4蒽酮硫酸法測(cè)定，以蟲草多糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蟲草多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.010 2x+0.093 4，R2=0.999 9。

取已制好的蟲草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.2.4高碘酸鉀比色法測(cè)定，以蟲草多酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蟲草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.010 4x+0.022，R2=0.999 7。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 分別取濃度為 40 μg·mL-1的腺苷、蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.2.4色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣六次，測(cè)得腺苷和蟲草素的峰面積，計(jì)算得RSD分別為0.059%和0.141%，表明儀器的精密度良好。分別取濃度為40 μg·mL-1的葡萄糖、甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.2.4 測(cè)定方法，連續(xù)測(cè)定6次，記錄OD值，計(jì)算得RSD分別為0.937%和1.114%，表明儀器的精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，精密稱取冬蟲夏草菌絲體粉6份，按照1.2.3制備供試品溶液，按照1.2.4測(cè)定條件測(cè)定腺苷、蟲草素，蟲草多糖和蟲草酸含量，計(jì)算得RSD分為1.463%，2.213%，3.672%，1.853%，證明本方法的重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取冬蟲夏草菌絲體粉，按照1.2.3制備供試品溶液，按照1.2.4測(cè)定條件分別在0、2、4、6、8 h測(cè)定，記錄腺苷和蟲草素的峰面積，記錄蟲草多糖和蟲草酸的OD值，計(jì)算得腺苷、蟲草素，蟲草多糖和蟲草酸的RSD分別為6.747%，2.262%，2.969%和1.607%，證明冬蟲夏草菌絲體中的腺苷、蟲草素、蟲草多糖和蟲草酸含量在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 蛹蟲草藥效物質(zhì)產(chǎn)量的測(cè)定 蛹蟲草產(chǎn)量的變化必然引起蛹蟲草藥效物質(zhì)產(chǎn)量的變化，本研究在測(cè)蛹蟲草產(chǎn)量的基礎(chǔ)上進(jìn)而測(cè)定了不同處理組蛹蟲草菌絲體粉和市售蛹蟲草菌絲體粉中的藥效物質(zhì)的含量，結(jié)果如表2～5。

表2 氮源對(duì)蛹蟲草菌絲體腺苷產(chǎn)量的影響 （μg·mg-1）

表3 氮源對(duì)蛹蟲草菌絲體蟲草素產(chǎn)量量的影響 （μg·mg-1）

表4 氮源對(duì)蛹蟲草菌絲體蟲草多糖產(chǎn)量的影響 （μg·mg-1）

表5 氮源對(duì)蛹蟲草菌絲體蟲草酸產(chǎn)量的影響 （μg·mg-1）

由表2、3、5可以看出，隨著蠶蛹粉浸提液添加量的不同，蛹蟲草中的腺苷、蟲草素、蟲草酸含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，五個(gè)處理組中，蛹蟲草腺苷、蟲草素、蟲草酸含量的差異幾乎都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.05）。五個(gè)處理組中蛹蟲草腺苷含量分別為2.103 μg·mg-1，2.836 μg·mg-1，3.411 μg·mg-1，2.115 μg·mg-1，1.659 μg·mg-1，蟲草素含量分別為 2.257 μg·mg-1，3.941 μg·mg-1，6.281 μg·mg-1，2.498 μg·mg-1，3.462 μg·mg-1，蟲草酸含量分別為28.756 μg·mg-1，33.743 μg·mg-1，42.756 μg·mg-1，19.795 μg·mg-1，31.679 μg·mg-1。其中PDA培養(yǎng)基添加10%蠶蛹粉浸提液時(shí)，蛹蟲草的腺苷、蟲草素和蟲草酸的含量均最高，分別為 3.411 μg·mg-1，6.281 μg·mg-1和 42.756 μg·mg-1，顯著高于其他各組，故選擇PDA培養(yǎng)基添加10%蠶蛹粉浸提液為蛹蟲草產(chǎn)腺苷、蟲草素和蟲草酸含量最高的栽培基質(zhì)。

由表4可以看出，蛹蟲草中的蟲草多糖的含量隨著蠶蛹粉浸提液添加量的增加而增加，5個(gè)處理組中，蛹蟲草蟲草多糖含量的差異幾乎都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.05）。5個(gè)處理組中蛹蟲草蟲草多糖含量分別為1.322 μg·mg-1、4.051 μg·mg-1、6.600 μg·mg-1、10.084 μg·mg-1和6.122 μg·mg-1，其中添加15%蠶蛹粉浸提液的PDA培養(yǎng)基中蛹蟲草的蟲草多糖含量最高，為10.084 μg·mg-1，顯著高于其他各組，但考慮到蛹蟲草的綜合藥效最高，故選擇PDA培養(yǎng)基添加10%的蠶蛹粉浸提液為蛹蟲草產(chǎn)藥效物質(zhì)含量最高的栽培基質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

蛹蟲草經(jīng)濟(jì)價(jià)值主要體現(xiàn)于其產(chǎn)量和藥效成分含量的高低，隨著蛹蟲草生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大和產(chǎn)品的開發(fā)，生產(chǎn)藥效價(jià)值高的蛹蟲草日益變成人們的迫切需求[5]。本研究測(cè)定了氮源對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量及4種藥效物質(zhì)腺苷、蟲草素、蟲草多糖和蟲草酸的含量的影響，并與市售蛹蟲草菌絲體粉中的這4種藥效成分含量做了對(duì)比。結(jié)果表明，PDA培養(yǎng)基添加10%蠶蛹粉浸提液時(shí)蛹蟲草的產(chǎn)量最高，藥效物質(zhì)含量也最高，且顯著高于市售蛹蟲草菌絲體粉的藥效成分含量，因此選用PDA培養(yǎng)基添加10%蠶蛹粉浸提液作為蛹蟲草的最佳栽培基質(zhì)，可用于蛹蟲草的大規(guī)模栽培種植。本研究中蛹蟲草腺苷、蟲草素和蟲草酸含量隨著培養(yǎng)基中蠶蛹粉含量的升高而出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這與李菲等[6]添加蠶蛹粉對(duì)蛹蟲草生長及子實(shí)體有效成分的影響的研究結(jié)果一致，而蟲草多糖含量隨著培養(yǎng)基中蠶蛹粉浸提液含量的升高而升高，其具體影響機(jī)制還有待研究。

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