小麥幼胚離體培養(yǎng)初步研究

李思琪，孫 寧，崔馳浩

（天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

小麥為中國(guó)三大糧食作物之一，2012年總產(chǎn)量達(dá)到1.2億t左右，是中國(guó)半數(shù)以上人的主糧。隨著人民生活水平的提高，對(duì)小麥產(chǎn)量及品質(zhì)有了更高的需求，因此，培育優(yōu)良小麥品種，提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)等研究具有重要意義。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將特定的外源基因?qū)胄←溨?，從而定向改良小麥品種，為小麥遺傳育種提供了一條新途徑，而建立高效的再生體系是小麥遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。研究表明，在篩選小麥離體培養(yǎng)再生體系時(shí)，幼胚是較好的試驗(yàn)材料，且目前已獲得了再生小麥苗。有學(xué)者認(rèn)為從小麥幼胚離體培養(yǎng)得到的小麥苗，其后代籽粒胚乳醇溶蛋白亞基和蛋白質(zhì)含量均有變化，建立幼胚高效再生體系并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，可改良其品質(zhì)。

本文以小麥品種遼春17幼胚為試材，對(duì)其進(jìn)行離體培養(yǎng)研究，以獲得高頻高效的再生體系，為小麥的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

取遼春17開花后13～16 d的幼穗，剝離籽粒，用75%乙醇浸泡40～60 s，無菌水沖洗4～5次，再用0.1% HgCl2表面滅菌7.5 min，無菌水沖洗6～7次后，剝?nèi)ビ着撸臃N于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基均以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g·L-1、0.7%瓊脂。其他成分見表1，調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.0，120 ℃高壓滅菌20 min，幼胚愈傷組織分化培養(yǎng)基激素配比見表2。

表1 幼胚愈傷組織誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng)基

表2 幼胚愈傷組織分化培養(yǎng)基激素配比

1.3 試驗(yàn)方法

幼胚愈傷組織誘導(dǎo)于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，15 d后選取色澤鮮艷且致密的胚性愈傷組織，繼代于愈傷組織繼代培養(yǎng)基中(15 d繼代1次)。分化培養(yǎng)采用光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度2 000 Lx，光照時(shí)間為12 h·d-1，溫度為25 ℃。接種后10 d左右統(tǒng)計(jì)出愈外植體數(shù)，觀察并記錄愈傷組織的顏色及質(zhì)地。轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)后實(shí)時(shí)觀察，統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生綠點(diǎn)的愈傷組織及分化出綠芽的愈傷數(shù)。出愈率、分化率計(jì)算公式如下 ：

出愈率/%=出愈外植體數(shù)÷接種外植體數(shù)×100%

分化率/%=分化出綠芽的愈傷數(shù)÷接種愈傷數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)

遼春17幼胚接種后4～6 d即可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，10 d左右不同激素處理的愈傷組織誘導(dǎo)率產(chǎn)生明顯差異。A組添加2,4-D（1 mg·L-1）、CH、Gln的處理平均出愈率高達(dá)93.8%，且出愈快，愈傷組織顏色鮮艷，致密，質(zhì)量較好。添加VB1、麥草畏的兩組處理出愈率反而有所降低（表3）。其中A2：2,4-D 1 mg·L-1、CH 200 mg·L-1、Gln 200 mg·L-1處理出愈率最高，為98.0%，說明添加VB1和麥草畏不如單獨(dú)使用2,4-D（1 mg·L-1）、CH、Gln的效果好。

表3 小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果

2.2 不同激素處理對(duì)愈傷組織分化的影響

不同激素對(duì)幼胚愈傷組織的分化率影響較大。在添加NAA(0.5 mg·L-1)的基礎(chǔ)上，KT的促進(jìn)效果明顯優(yōu)于6-BA與TDZ，培養(yǎng)基中添加適量的KT會(huì)獲得較高的綠點(diǎn)率及分化率。其中D1處理的愈傷組織分化率最高為66.7%，而F1處理的組織分化率最低為35.4%（表4）。結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基添加NAA 0.5 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1為遼春17幼胚愈傷組織分化較為理想的培養(yǎng)基配方。

表4 幼胚愈傷組織分化培養(yǎng)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

生長(zhǎng)素2,4-D被廣泛應(yīng)用于植物離體培養(yǎng)過程中促進(jìn)細(xì)胞分裂與愈傷組織的獲得。近年來，麥草畏也在小麥、大麥、玉米等禾谷類植物研究中用于愈傷組織的誘導(dǎo)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在添加2,4-D 1 mg·L-1基礎(chǔ)上，添加麥草畏1～4 mg·L-1反而會(huì)使幼胚出愈率降低，說明不同小麥品種在選擇誘導(dǎo)愈傷組織形成的激素種類上有所不同。郭向云等研究表明，在小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)、繼代和分化的培養(yǎng)基中添加VB1有利于胚性愈傷組織的發(fā)生，可降低非胚性愈傷組織的發(fā)生頻率，能顯著提高小麥幼胚愈傷組織的分化能力。但在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)添加VB1時(shí)小麥愈傷組織誘導(dǎo)率降低，因此，在今后研究中，應(yīng)在保證高愈傷組織誘導(dǎo)率的基礎(chǔ)上篩選VB1使用的最適濃度。

胚源愈傷組織再分化是形成小麥幼胚愈傷組織再生植株的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。林毅等研究發(fā)現(xiàn)，在適宜的培養(yǎng)條件下，分化率能達(dá)到99%；但大多研究結(jié)果證明，再生率在不同基因型之間表現(xiàn)出較大的差異，同時(shí)，分化率與外植體類型、外源激素種類均有很大的相關(guān)性。本試驗(yàn)選用NAA與KT、6-BA、TDZ配合使用發(fā)現(xiàn)，NAA 0.5 mg·L-1與KT 1.0 mg·L-1配合使用分化率高達(dá)66.7%，與其他處理最低相差31.3%。

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