益氣活血方對大鼠心肌梗死邊緣區(qū)Sigma-1R、SERCA2a、IP3R mRNA表達的影響

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心力衰竭是各種心血管系統(tǒng)疾病發(fā)展的終末階段，其臨床表現(xiàn)復雜，預后不良，死亡率極高，嚴重危害著人類的生命健康。心力衰竭的病理機制較為復雜，其中心環(huán)節(jié)是心臟結構和功能的失代償。臨床和基礎研究均表明，心力衰竭的發(fā)生與心肌細胞內(nèi)各種亞細胞器損傷及其聯(lián)系失衡(也稱為亞細胞器重構)導致細胞損傷、心臟結構和功能的失代償密切相關[1-3]。同時，心肌能量代謝紊亂亦是心力衰竭時心室重構和心功能異常的重要機制之一。既往研究證明，益氣活血方藥除了能擴張冠脈、抑制血小板聚集、清除氧自由基等改善血流動力學機制外，能增加肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性，改善心肌能量代謝[4]，減輕心室重構和改善心功能，發(fā)揮心肌保護作用[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Sigma-1受體(Sigma-1 receptor，Sigma-1R)作為內(nèi)質網(wǎng)/線粒體信號調(diào)制器，通過改善亞細胞器間Ca2+信號轉導，與三磷酸肌醇受體[inositol(1，4，5)-triphosphate receptor，IP3R]相互作用，間接影響Ca2+-ATP酶(SERCA2a)活性，促進心肌細胞存活，最終通過抑制心室重構和改善心肌能量代謝緩解心力衰竭[6-7]。本研究制備心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，通過觀察益氣活血方對該模型心肌梗死邊緣區(qū)Sigma-1R、SERCA2a、IP3R mRNA表達的影響，進一步探討其保護心肌細胞的作用及可能機制，為臨床治療心力衰竭明確新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康雄性SD大鼠25只，6周齡，SPF級，體質量(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：scxk(京)2012-0001。實驗期間飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學教育部重點實驗室SPF級實驗動物房。

1.2 實驗儀器 ALC-V8 動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)；心電圖機(廈門錫爾摩電氣有限公司，F(xiàn)X-7402 Cardimax)；Vevo高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics公司，TM2100型)；千分之一電子天平(上海精密科學儀器有限公司，JA1003N型)；4 ℃離心機(上海滬粵明科學儀器有限公司，TGL-16G)；Gene Quant紫外分光光度計(Pharmacia Biotech公司)；基因擴增儀GeneAmp PCR system 9700(美國AB公司，Applied Biosystems)；安捷倫實時熒光定量PCR儀Mx3000P(美國安捷倫科技公司)。

1.3 試劑 Trizol試劑(批號：15596026，美國Ambion公司)；反轉錄試劑盒(批號：K1622，美國ThermoFisher Scientific公司)；SYBR Green PCR Master Mix(美國ABI公司)。所用引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

1.4 心肌梗死大鼠模型制備 采用大鼠左冠狀動脈前降支結扎法制備大鼠急性心肌梗死模型[8]。大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉后仰臥位固定，經(jīng)喉行氣管插管術，連接呼吸機，以80次/min、潮氣量(0.7～0.8) mL行人工呼吸。左胸前區(qū)去毛備皮，絡合碘消毒，在左側第三、四肋處橫向切開皮膚，長1.5 cm，鈍性分離肌層，沿第三、四肋間隙打開胸腔，以開胸器擴大手術視野，撕開心包，在動脈圓錐與左心耳之間下2 mm處用5/0線結扎左冠狀動脈前降支(假手術組只穿線，不結扎)，復位心臟，逐層縫合，心電圖示ST段抬高為造模成功。術后連續(xù)3 d注射青霉素預防感染，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 動物分組及給藥 造模大鼠術后隨機分為模型組、益氣活血低劑量組(益低組)、益氣活血高劑量組(益高組)和氟伏沙明(Sigma-1R激動劑)組。益低組和益高組分別予以含生藥量15 g/kg、30 g/kg的益氣活血方藥物，氟伏沙明組予以氟伏沙明(1 mg/kg)灌胃；模型組和假手術組大鼠給予與治療組同等容積的蒸餾水灌胃，每日1次，于造模后24 h開始，連續(xù)8周(每組大鼠10只)。益氣活血方組方：黃芪40 g，黨參40 g，丹參20 g，川芎20 g，赤芍20 g，紅花20 g。由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院藥房提供。由本實驗室水煎濃縮制備，分裝4 ℃保存。氟伏沙明為進口藥品，注冊證號 H20140519 ，荷蘭Abbott Healthcare Products B.V公司生產(chǎn)。

1.6 大鼠超聲心動圖檢測 大鼠連續(xù)給藥8周后，1%戊巴比妥鈉50 mg/kg體重腹腔麻醉，仰臥位固定于鼠板，胸部備皮，應用超聲診斷儀和高頻線陣探頭檢測心臟結構和功能。心臟檢測，取胸骨旁左室長軸切面，由二維超聲引導M型曲線進行測量。

1.7 心臟質量指數(shù)測量 術后8周，稱量體重，麻醉，開胸取心臟，剪去非心組織，蘸干水分，用精密天平稱量心臟質量，計算心臟質量/體質量(mg/g)，即為心臟質量指數(shù)。

1.8 心肌組織Sigma-1R、SERCA2a、IP3R mRNA的檢測 取大鼠心肌梗死邊緣區(qū)組織冰上勻漿，Trizol法提取心肌組織總RNA。測定吸光度A260，A280，計算RNA濃度及純度。取2 μg總RNA，根據(jù)說明書配制 20 μL 反應體系，在42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min條件下進行反轉錄，得到 cDNA 鏈。以 cDNA 為模板采用real-time PCR法檢測心肌組織Sigma-1R、SERCA2a、IP3R mRNA的相對表達量。擴增條件為：95 ℃10 min預變性，95 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40次循環(huán)。Sigma-1R、SRECA2a、IP3R mRNA的相對表達量按照2-△△ct法計算。引物序列詳見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 超聲心動圖結果 在冠狀動脈結扎術后8周，大鼠的心臟結構發(fā)生了重構，與假手術組相比，模型組大鼠左室舒張末內(nèi)徑(LVDd)、左室收縮末內(nèi)徑(LVDs)、左室舒張末期容積(LV VoLd)、左室收縮末期容積(LV VoLs)顯著增加(P<0.01)，左室后壁舒張末厚度(LVPWTd)、左室后壁收縮末厚度(LVPWTs)顯著降低，而各藥物組大鼠上述心肌重構指標較模型組有不同程度減輕(P<0.01)。同時，超聲心動圖結果發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，模型組大鼠的心臟射血分數(shù)(EF)、短軸縮短率(FS)顯著降低(P<0.01)，而各藥物組可以顯著改善心肌梗死大鼠心臟EF、FS(P<0.01)。詳見表2、表3。

表2 大鼠冠狀動脈結扎后益氣活血方干預 8 周超聲心動圖檢測的形態(tài)學指標比較(±s)

表3 大鼠冠狀動脈結扎后益氣活血方干預 8 周超聲心動圖檢測的功能學指標比較(±s) %

2.2 心臟質量指數(shù) 與假手術組比較，模型組大鼠心臟質量指數(shù)顯著增加(P<0.01)。與模型組比較，益氣活血低劑量組、益氣活血高劑量組和氟伏沙明組大鼠的心臟質量指數(shù)均顯著降低(P<0.01)。詳見表4。

表4 各組大鼠心臟質量指數(shù)比較(±s) mg/g

2.3 心肌組織Sigma-1R、SERCA2a、IP3R mRNA表達 每組取5只檢測，與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織Sigma-1R、SERCA2a的表達降低(P<0.05)，IP3R mRNA表達明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，各藥物組的Sigma-1R表達均顯著上調(diào)(P<0.01)；益低組SERCA2a無統(tǒng)計學意義，益高組SERCA2a表達明顯增加(P<0.01)，氟伏沙明組SERCA2a表達增加(P<0.05)；益低組、益高組IP3R mRNA與模型組比較表達降低(P<0.05)，氟伏沙明組IP3R mRNA表達顯著降低(P<0.01)。詳見表5。

表5 各組 Sigma-1R、SERCA2a、IP3R mRNA水平比較 (2-△△Ct,±s)

3 討 論

本實驗采用左冠狀動脈前降支結扎法制備大鼠心肌梗死后心力衰竭模型，模擬臨床上較為常見的缺血性心臟病如冠心病心肌梗死所致的心力衰竭，是現(xiàn)今成熟且公認的心力衰竭動物模型[8]。同時針對該模型氣虛血瘀的病機關鍵，構建臨床經(jīng)驗方益氣活血方，方中黃芪、黨參益氣生血，丹參、川芎、赤芍、紅花活血祛瘀，全方具有扶正祛邪、標本兼顧的特點。研究表明，通過超聲心動圖、心臟質量指數(shù)檢測，以Sigma-1R激動劑氟伏沙明作為陽性對照藥物，結果顯示益氣活血方低劑量組、高劑量組不同程度地對心肌梗死后心力衰竭模型大鼠左室重構及心功能有改善作用，其機制與調(diào)節(jié)Sigma-1R及其相關信號分子表達有關。

越來越多的研究表明，Sigma-1R作為細胞內(nèi)信號調(diào)制器，結合不同的配體，調(diào)控心血管系統(tǒng)的功能[6- 9]，包括調(diào)控細胞器之間信號轉導、Ca2+轉運、細胞能量代謝以及緩解內(nèi)質網(wǎng)應激損傷，促進細胞存活[6]，在改善心肌細胞缺血缺氧，減輕心室重構，改善心功能等方面發(fā)揮著重要作用。Sigma-1R是內(nèi)質網(wǎng)重要的伴侶蛋白，研究表明Sigma-1R在大鼠心臟[10]、腎臟[11]和胸主動脈[12]高表達。在細胞中Sigma-1R通常駐留在內(nèi)質網(wǎng)與線粒體相接觸稱為線粒體相關內(nèi)質網(wǎng)膜(mitochondrion associated ER membrane，MAM)區(qū)域。在此區(qū)域Sigma-1R通過調(diào)節(jié)線粒體/內(nèi)質網(wǎng)之間信號通路，影響線粒體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和細胞的能量代謝，決定細胞存活[7]。

已有研究發(fā)現(xiàn)，正常生理條件下，位于MAM區(qū)的Sigma-1R與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)在內(nèi)質網(wǎng)膜形成Ca2+敏感復合物。在Sigma-1R激動劑的刺激下，Sigma-1R與GRP78解離，與內(nèi)質網(wǎng)膜上構象不穩(wěn)定的IP3R相互作用，增強從內(nèi)質網(wǎng)向線粒體轉運的Ca2+信號[13- 14]，通過恢復線粒體大小[15]及三羧酸循環(huán)增加產(chǎn)能，增加ATP。并進一步增加內(nèi)質網(wǎng)SERCA2a酶活性，使肌漿網(wǎng)的Ca2+升高，最終通過改善心肌細胞Ca2+循環(huán)障礙和能量代謝緩解心力衰竭[7]。為證實Sigma-1R在該過程中起主要調(diào)節(jié)作用，有研究者應用Sigma-1R拮抗劑刺激，觀察到Sigma-1R抑制劑不可逆地結合Sigma-1R，抑制其表達并削弱Sigma-1R與IP3R形成復合體，抑制Ca2+進入線粒體，并誘導內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放到胞質，從而導致線粒體ATP減少，導致不良心肌的重構和心功能惡化[16-19]。許多Sigma-1R激動劑和拮抗劑的一系列實驗表明，Sigma-1R調(diào)控的內(nèi)質網(wǎng)/線粒體間Ca2+轉運，影響SERCA2a酶活性，改善亞細胞器損傷和心肌能量代謝，減輕心力衰竭時心室重構和心功能惡化。

臨床實踐表明，益氣活血方藥治療心血管疾病作用顯著，但其作用機制尚未完全闡明。本實驗通過檢測益氣活血方對心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌梗死邊緣區(qū)Sigma-1R、SERCA2a、IP3R mRNA表達的影響，以期發(fā)現(xiàn)其作用的分子機制，指導臨床實踐。

本研究表明益氣活血方可能是通過上調(diào)Sigma-1R、SERCA2a mRNA的表達，抑制IP3R mRNA表達，調(diào)控內(nèi)質網(wǎng)及線粒體間Ca2+信號轉導起到保護心肌細胞的作用。但亞細胞器間信號轉導是一個復雜的網(wǎng)絡結構，對于Sigma-1R在保護心肌細胞及益氣活血方對其影響更為深入的分子機制，仍需進一步研究，從而為心血管疾病的治療明確新靶點。

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