不同壁材對乳化溶劑蒸發(fā)法制備南極磷蝦油納米乳的影響

張 建 潤, 張 晶, 宋 亮,2, 王 梟, 栗 冰 瑩, 周 大 勇,2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院， 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 國家海洋食品工程技術(shù)研究中心， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

南極磷蝦油富含磷脂型多不飽和脂肪酸和酯型蝦青素[1]，具有降血脂、降血壓、抗氧化等活性，有較高的開發(fā)利用價(jià)值[2]。磷脂型多不飽和脂肪酸和酯型蝦青素是南極磷蝦油的特色功能性成分，但穩(wěn)定性差，南極磷蝦油易失去活性[3]。此外，南極磷蝦油腥味較重，水溶性較差，限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

包埋載體技術(shù)可改善水溶性和提高穩(wěn)定性，但粒徑較大且功能活性物質(zhì)損耗較高，食品工業(yè)迫切需要新的包埋技術(shù)，因此多種納米包埋技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生[4]。乳化溶劑蒸發(fā)法是將與水互溶的溶劑作為水相，與水不互溶的有機(jī)溶劑作為油相，水相與油相接觸時(shí)會(huì)形成納米乳[5]，在制備的過程中不會(huì)產(chǎn)生高溫，可以更好地保留蝦青素等熱敏性功能組分。已有文獻(xiàn)報(bào)道采用乳化溶劑蒸發(fā)法制備納米乳(粒)，但主要集中在載藥體系的研究[6]。目前對于此方法主要側(cè)重于制備工藝優(yōu)化的探討，對制備前后油脂組分變化及南極磷蝦油納米乳鮮有報(bào)道。

本研究采用乳化溶劑蒸發(fā)法制備南極磷蝦油納米乳，檢測包埋率、粒徑、分散指數(shù)、Zeta電位、微觀形態(tài)、熱穩(wěn)定性及脂肪酸組成及相對含量等指標(biāo)確定最佳壁材。以期為南極磷蝦油納米乳的制備提供簡便有效的方法，提高南極磷蝦油功能組分的穩(wěn)定性，進(jìn)一步提升南極磷蝦油產(chǎn)品的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦油，大連遼漁集團(tuán)有限公司提供凍干南極磷蝦，實(shí)驗(yàn)室自提蝦油；酪蛋白酸鈉、大豆分離蛋白、硬脂酸、玉米醇溶蛋白，上海生工試劑有限公司；阿拉伯膠、吐溫-20，天津大茂試劑有限公司；正己烷、甲醇，色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T-25型勻漿機(jī)，德國IKA集團(tuán)；PandaPLUS 2000高壓均質(zhì)機(jī)，意大利GEA公司；SU-8010型電子掃描顯微鏡，日本日立集團(tuán)；Mastersizer 2000激光粒度儀，英國馬爾文集團(tuán)；μSC差示掃描微量熱儀，法國SETARAM公司；Agilent 7890A氣相質(zhì)譜儀，美國Agilent公司。

1.3 方 法

1.3.1 南極磷蝦油的提取

將南極磷蝦與正己烷按料液比1∶15混合，在37 ℃下攪拌1 h，隨后靜置12 h，收集上清液，旋蒸除去正己烷得到南極磷蝦油，充氮密封。

1.3.2 南極磷蝦油納米乳的制備

1.3.2.1 水相的制備

以乳清分離蛋白為壁材，將1%的吐溫-20與乳清分離蛋白按質(zhì)量比1∶1溶于0.01 mol/L、pH 7的PBS緩沖液中；以酪蛋白酸鈉為壁材，將2.5%穩(wěn)定劑(65%酪蛋白酸鈉，6%阿拉伯膠，29%吐溫-20)溶于PBS緩沖液；以硬脂酸為壁材，1%蔗糖脂溶于PBS緩沖液;以玉米醇溶蛋白為壁材,將3%的吐溫-20溶于0.01 mol/L、pH 4的PBS緩沖液。

1.3.2.2 油相的制備

以乳清分離蛋白為壁材，將0.3 g南極磷蝦油溶于20 mL乙醇溶液；以酪蛋白酸鈉為壁材，將0.3 g南極磷蝦油溶于20 mL乙醇溶液[7]；以硬脂酸為壁材，將0.3 g南極磷蝦油與0.3 g硬脂酸結(jié)合溶于20 mL乙醇溶液；以玉米醇溶蛋白為壁材，將0.3 g南極磷蝦油與1.5 g玉米醇溶蛋白溶解在30 mL 85%的乙醇[8]。

1.3.2.3 納米乳的制備

將油相與水相按體積比1∶9混合，40 ℃攪拌1 h，在6 000～10 000 r/min勻漿5～10 min；在0、30、60 MPa壓力下分別均質(zhì)1次，在 80 MPa 壓力下循環(huán)均質(zhì)3次，旋蒸除去乳液中的有機(jī)溶劑，得到納米乳[9]。

1.3.3 納米乳包埋率的檢測

采用氣相色譜法，以EPA作為標(biāo)準(zhǔn)品得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=445 866x-4×106，R2=0.991 6。

稱取2 g樣品，加入15 mL石油醚，90 r/min振蕩30 min提取表面油[9]；稱取2 g樣品溶解到12 mL去離子水中，37 ℃恒溫振蕩0.5 h，加入4 mL 氨水，再依次分別加入16 mL乙醇、石油醚與正己烷，恒溫振蕩0.5 h，8 000 r/min離心10 min，提取上清液，旋蒸除去有機(jī)溶劑得到總油。分別測定總油與表面油中EPA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算納米乳包埋率[10]：

包埋率=(wt-w)/wt×100%

式中：wt為總油中EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)，w為表面油中EPA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4 納米乳粒徑分布、分散指數(shù)、Zeta電位的測定

將納米乳溶于去離子水中，按體積比1∶20進(jìn)行稀釋，采用激光粒度儀測定粒徑、分散指數(shù)及Zeta電位。實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃，探測角度為90°，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果通過Mastersizer 2000軟件進(jìn)行分析。

1.3.5 掃描電鏡觀察

取適量凍干樣品進(jìn)行掃描電鏡分析，加速電壓為3 kV。

1.3.6 差示掃描量熱分析

將納米乳凍干樣品100 mg置于鋁鍋中密封，以空鋁鍋?zhàn)鳛榭瞻讓φ眨貜?fù)測定3次。樣品從20 ℃加熱至100 ℃，再冷卻至10 ℃，速率為1 ℃/min[4]。通過Processing軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.7 脂肪酸組成及相對含量測定

采用文獻(xiàn)[11]的方法檢測并分析南極磷蝦油與包埋油中脂肪酸的組成及相對含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示，采用SPSS16.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，在P<0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 包埋率

經(jīng)過計(jì)算以乳清分離蛋白、酪蛋白酸鈉、硬脂酸、玉米醇溶蛋白為壁材制備納米乳包埋率分別為(76.45±1.96)%、(76.03±1.27)%、(78.82±1.35)%、(63.95±1.56)%。結(jié)果表明，前三者無顯著性差異(P>0.05)，均在76%以上；而以玉米醇溶蛋白為壁材制備納米乳包埋率最低(P<0.05)，說明以乳清分離蛋白、酪蛋白酸鈉、硬脂酸作為壁材對南極磷蝦油的包埋效果好，結(jié)合能力強(qiáng)，可以更好地進(jìn)行包埋。

2.2 粒徑、分散指數(shù)與Zeta電位

不同壁材制備南極磷蝦油納米乳粒徑分布如圖1所示。以乳清分離蛋白、酪蛋白酸鈉、硬脂酸和玉米醇溶蛋白為壁材，制備的納米乳平均粒徑分別為(113.48±3.17)、(141.92±3.38)、(5 606.43±131.08)、(197.24±6.02) nm；分散指數(shù)分別為0.371、0.359、1、0.489。結(jié)果表明，以乳清分離蛋白、酪蛋白酸鈉和玉米醇溶蛋白為壁材制備納米乳的粒徑達(dá)到納米級，分散性能較為穩(wěn)定，納米顆粒不易發(fā)生凝聚產(chǎn)生沉淀。納米乳粒徑越小，表面積越大，穩(wěn)定性越低[12]；而在相同粒徑尺寸下，分散指數(shù)越小，穩(wěn)定性越強(qiáng)[13]。分散指數(shù)表示溶液中的分散程度，分散指數(shù)在0.2～0.5，說明納米乳分散效果較好。以乳清分離蛋白、酪蛋白酸鈉及玉米醇溶蛋白作為壁材制備納米乳分散性較好，而以硬脂酸為壁材制備的納米乳，在溶液中已經(jīng)聚集，分散性較差。

不同壁材制備南極磷蝦油納米乳的Zeta電位結(jié)果如圖2所示。以乳清分離蛋白、酪蛋白酸鈉、硬脂酸、玉米醇溶蛋白為壁材制備納米乳，Zeta電位分別為(-4.25±1.91)、(-22.65±3.32)、(-61.95±0.49)、(-32.3±3.39) mV。以乳清分離蛋白為壁材制備納米乳，電荷較低，相互排斥作用較弱，容易出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，產(chǎn)生沉淀；而以其他3種材料為壁材制備納米乳，均帶有不同程度的負(fù)電荷，同種電荷互相排斥，不會(huì)產(chǎn)生聚沉現(xiàn)象，并且由于納米乳粒徑較小，受到重力作用較弱，布朗運(yùn)動(dòng)可以使其平衡，具有較好的穩(wěn)定性[6]。

MAO等[14]采用乳清分離蛋白為壁材制備的類胡蘿卜素油脂納米乳，其粒徑為(132.0±2.5) nm，Zeta電位為(-7.14±0.7) mV；Ilyasoglu 等[15]采用酪蛋白酸鈉為壁材制備魚油納米乳，其包埋率為(78.88±2.89)%，粒徑為232.2 nm，Zeta電位為-25 mV；Parris等[16]采用玉米醇溶蛋白為壁材制備玉米油納米乳，粒徑為100 nm，Zeta電位為-30 mV；Zhu等[10]采用硬脂酸為壁材制備南極磷蝦油納米乳，粒徑為 143.5 nm，Zeta電位為-57.4 mV。本研究采用3種蛋白為壁材制備的南極磷蝦油納米乳，其表征參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相接近。蛋白質(zhì)與芯材的親和力對納米乳的形成較為重要，不同種類壁材的乳化活性和穩(wěn)定性不同，對制備的納米乳粒徑大小具有一定影響[16]。而本研究采用硬脂酸為壁材制備的南極磷蝦油納米乳與文獻(xiàn)[10]的報(bào)道結(jié)果有較大的差異，可能是由于在其制備的過程中采用不同的乳化劑所致。

(a) 乳清分離蛋白

(b) 酪蛋白酸鈉

(c) 硬脂酸

(d) 玉米醇溶蛋白

(a) 乳清分離蛋白

(b) 酪蛋白酸鈉

(c) 硬脂酸

2.3 微觀形態(tài)

通過掃描電鏡觀察4種壁材制備納米乳的形態(tài)，如圖3所示。以乳清分離蛋白、硬脂酸、玉米醇溶蛋白為壁材制備的納米乳，形態(tài)均為片狀，可能是南極磷蝦油與不同壁材的結(jié)合程度不同，在乳化過程中發(fā)生了一定程度的聚集；或者由于凍干過程脫水導(dǎo)致制備的納米乳發(fā)生聚集，形成片狀結(jié)構(gòu)。而以酪蛋白酸鈉為壁材制備的納米乳，形態(tài)為直徑100 nm左右的球形，在凍干過程中，壁材含有的親水與疏水基團(tuán)不會(huì)使其產(chǎn)生聚集。

(a) 乳清分離蛋白

(b) 酪蛋白酸鈉

(c) 硬脂酸

(d) 玉米醇溶蛋白

2.4 熱穩(wěn)定性

不同壁材制備的南極磷蝦油納米乳樣品的熱穩(wěn)定性如圖4所示。以乳清分離蛋白和酪蛋白酸鈉為壁材，在升溫過程中出現(xiàn)兩個(gè)峰，表明生成兩種晶體，即α-晶體和β-晶體[16]，最高可承受溫度分別為(44.46±0.74)和(62.84±0.53) ℃(圖4(a)、(b))；以硬脂酸和玉米醇溶蛋白為壁材，在升溫過程只出現(xiàn)一個(gè)峰，表明只生成一種晶體，即α-晶體，最高可承受溫度分別為(62.22±0.01)和(28.72±0.62) ℃(圖4(c)、(d))。α-晶體分子排列無序，而β-晶體分子排列有序，α-晶體融化溫度低于β-晶體[4,17]。以乳清分離蛋白和酪蛋白酸鈉為壁材制備納米乳，均生成了β-晶體，其中酪蛋白酸鈉為壁材制備納米乳的承受溫度較高，其熱穩(wěn)定性較好。以玉米醇溶蛋白為壁材制備納米乳只生成了α-晶體，其最高可承受溫度較低，熱穩(wěn)定性較差。而以硬脂酸為壁材制備納米乳，雖只生成α-晶體，但其最高可承受(62.22±0.01) ℃，推測是由于硬脂酸是飽和脂肪酸形成晶體可承受的溫度較高，與文獻(xiàn)[4,10]結(jié)果相近。酪蛋白酸鈉在加熱過程中會(huì)使絲氨酸磷酸基團(tuán)丟失，使得酪蛋白酸鈉與酪蛋白酸鈉之間相互作用增強(qiáng)[18]，承受溫度提高。

(a) 乳清分離蛋白

(b) 酪蛋白酸鈉

(c) 硬脂酸

(d) 玉米醇溶蛋白

2.5 脂肪酸組成及相對含量

南極磷蝦油納米乳中脂肪酸組成與相對含量如表1所示。以酪蛋白酸鈉為壁材，多不飽和脂肪酸相對含量最高(P<0.05)；以玉米醇溶蛋白和乳清分離蛋白為壁材，多不飽和脂肪酸相對含量次之。以酪蛋白酸鈉為壁材，EPA和DHA相對含量最高(P<0.05)；玉米醇溶蛋白和乳清分離蛋白為壁材，EPA和DHA相對含量次之；而以硬脂酸為壁材，EPA和DHA相對含量最低(P<0.05)。同時(shí)，與南極磷蝦油相比較，以酪蛋白酸鈉為壁材制備納米乳，多不飽和脂肪酸，尤其EPA和DHA相對含量均未發(fā)生明顯下降。酪蛋白酸鈉作為壁材包埋南極磷蝦油，納米乳中脂肪酸組成和相對含量與南極磷蝦油最接近，酪蛋白酸鈉中含有的親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)可與南極磷蝦油進(jìn)行結(jié)合，達(dá)到最佳效果。

表1 不同壁材制備南極磷蝦油納米乳中脂肪酸組成及相對含量

3 結(jié) 論

采用乳清分離蛋白、酪蛋白酸鈉、硬脂酸和玉米醇溶蛋白4種壁材，基于乳化溶劑蒸發(fā)法制備了南極磷蝦油納米乳。結(jié)果表明，以酪蛋白酸鈉為壁材制備的南極磷蝦油納米乳，包埋率為(76.03±1.27)%，粒徑為(141.92±3.38) nm，Zeta電位為(-22.65±3.32) mV，分散系數(shù)較??；納米乳形態(tài)最好，為球形納米粒，可承受溫度最高，熱穩(wěn)定性最好。脂肪酸組成及相對含量分析發(fā)現(xiàn)，與南極磷蝦油相比較，以酪蛋白酸鈉為壁材制備的納米乳中多不飽和脂肪酸相對含量，尤其是EPA和DHA相對含量均未見下降，可較好保留南極磷蝦油功能組分。

[1] ULVEN S M, KIRKHUS B, LAMGLAIT A, et al. Metabolic effects of krill oil are essentially similar to those of fish oil but at lower dose of EPA and DHA, in healthy volunteers[J]. Lipids, 2011, 46(1): 37-46.

[2] 賀瑞坤,羅海吉.南極磷蝦油對人體健康的作用[J].食品研究與開發(fā),2013,34(20):130-133.

[3] YOSHITOMI B, HIDEAKI Y. Chemical composition of dried eyeballs fromEuphausiasuperbaandEuphausiapacifica[J]. Fisheries Science, 2007, 73(5): 1186-1194.

[4] IOANA L, ELENA M, NICOLATA B, et al. Lipid nanoparticles based on omega-3 fatty acids as effective carriers for lutein delivery. Preparation andinvitrocharacterization studies[J]. Journal of Functional Foods, 2013, 5(3): 1260-1269.

[5] ZOU L, ZHENG B, ZHANG R, et al. Food-grade nanoparticles for encapsulation, protection and delivery of curcumin: comparison of lipid, protein, and phospholipid nanoparticles under simulated gastrointestinal conditions[J]. Royal Society of Chemistry Advances, 2016, 6(4): 3126-3136.

[6] 邢潔,張典瑞,張學(xué)順,等.冬凌草甲素聚乳酸納米粒的制備和體外性質(zhì)研究[J].中國藥學(xué)雜志,2007,42(13):1006-1010.

[7] ANARJAN N, TAN C P, NEHDI I A, et al. Colloidal astaxanthin: preparation, characterisation and bioavailability evaluation[J]. Food Chemistry, 2012, 135(3): 1303-1309.

[8] PARRIS N, COOKE P H, HICKS K B. Encapsulation of essential oils in zein nanospherical particles[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(12): 4788-4792.

[9] ANARJAN N, JAFARIZADEH-MALMIRI H, NEHDI I A, et al. Effects of homogenization process parameters on physicochemical properties of astaxanthin nanodispersions prepared using a solvent-diffusion technique[J]. International Journal of Nanomedicine, 2015, 10: 1109-1118.

[10] ZHU J J, ZHUANG P, LUAN L L, et al. Preparation and characterization of novel nanocarriers containing krill oil for food application[J]. Journal of Functional Foods, 2015, 19(B): 902-912.

[11] YIN F W, LIU X Y, FAN X R, et al. Extrusion of Antarctic krill (Euphausiasuperba) meal and its effect on oil extraction[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2015, 50(3): 633-639.

[12] TAN C P, NAKAJIMA M. β-carotene nanodispersions: preparation, characterization and stability evaluation[J]. Food Chemistry, 2005, 92(4): 661-671.

[13] GANESAN N. Stability of thin emulsion film between two oil phases with a viscoelastic liquid-liquid interface[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2009, 330(2): 494-500.

[14] MAO L, XU D, YANG J, et al. Effects of small and large molecule emulsifiers on the characteristics of β-carotenenanomulsions prepared by high pressure homogenization[J]. Food Technology and Biotechnology, 2009, 47(3): 336-342.

[15] ILYASOGLU H, EI S N. Nanoencapsulation of EPA/DHA with sodium caseinate-gum arabic complex and its usage in the enrichment of fruit juice[J]. LWT-Food Science and Technology, 2014, 56(2): 461-468.

[16] SALMINEN H, HELGASON T, KRISTINSSON B, et al. Tuning of shell thickness of solid lipid particles impacts the chemical stability of encapsulated ω-3 fish oil[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2017, 490: 207-216.

[17] CHU B-S, ICHIKAWA S, KANAFUSA S, et al. Preparation and characterization of β-carotene nanodispersions prepared by solvent displacement technique[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(16): 6754-6760.

[18] SRINIVASAN M, SINGH H, MUNRO P A. Formation and stability of sodium caseinate emulsions: influence of retorting (121 ℃ for 15 min) before or after emulsification[J]. Food Hydrocolloids, 2002, 16(2): 153-160.