大氣中細(xì)顆粒物對(duì)肺癌細(xì)胞A549遷移和侵襲作用的影響

樊磊，劉順，包艷英，張英杰，劉穎，屈超，張治然，襲榮剛，王曉波,*

1. 中國(guó)人民解放軍第210醫(yī)院藥學(xué)部，大連 116021 2. 大連市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，大連 116023

自1985年以來(lái)，肺癌已成為全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。據(jù)《中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》2015年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)[1]數(shù)據(jù)顯示，肺癌也是中國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，在過(guò)去的30年中，肺癌死亡率在中國(guó)上升了465%。國(guó)內(nèi)外環(huán)境流行病學(xué)研究表明，大氣污染程度與城市居民肺癌的發(fā)病率和死亡率關(guān)聯(lián)密切[2]。據(jù)Anenberg等[3]統(tǒng)計(jì)分析，目前全球每年約有14～30萬(wàn)例肺癌患者的死亡與大氣中細(xì)顆粒物暴露有關(guān)。Pope等[4]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大氣中細(xì)顆粒物濃度每升高10 μg·mL-1，肺癌病死率增加約8%。雖然流行病學(xué)調(diào)查顯示肺癌發(fā)病率和病死率與大氣中細(xì)顆粒物具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，但其因果聯(lián)系尚待進(jìn)一步的毒理學(xué)、生物學(xué)等機(jī)制研究予以闡明。以PM2.5為代表的大氣細(xì)顆粒物是目前研究的熱點(diǎn)，其粒徑小，表面積大，易富集各種重金屬及多環(huán)芳烴等有機(jī)物和病原微生物。這些顆粒物可沉積在細(xì)小支氣管和肺泡[5]，并容易通過(guò)肺泡內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5可通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生心血管毒性[6]、加速皮膚細(xì)胞衰老、導(dǎo)致胚胎畸形[7]。PM2.5的致癌作用主要與其可導(dǎo)致遺傳毒性、激活氧化應(yīng)激通路、免疫損傷以及慢性炎癥反應(yīng)等作用有關(guān)[8-10]。

由于肺癌發(fā)病隱匿，早期往往沒(méi)有任何癥狀。所以，在臨床中發(fā)現(xiàn)的肺癌患者確診時(shí)約有80%以上已發(fā)展到中晚期，患者五年生存率不足10%[11]。肺癌轉(zhuǎn)移是影響患者生存期限的主要因素，PM2.5是否能促進(jìn)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移目前尚不清楚，因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察了PM2.5對(duì)A549肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)表型的影響，旨在進(jìn)一步闡明PM2.5對(duì)肺癌發(fā)生發(fā)展的作用及其機(jī)制，為對(duì)其醫(yī)學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑與儀器

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。Gibco杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)和Gibco胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，抗體MMP-2、抗體MMP-9、抗體E-cadherin、抗體N-cadherin和抗體GAPDH-A均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，人工基底膜Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司，TGL-20M高速臺(tái)式冰凍離心機(jī)購(gòu)自中國(guó)湘儀公司，PAC300 型電泳儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司，TS 2000A 型脫色搖床購(gòu)自江蘇海門市分析儀器廠，Amersham Imager 600化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)GE公司，BPN-150CRH型CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自蘇州貝茵醫(yī)療器械有限公司，PQ200 環(huán)境級(jí)精細(xì)顆粒物采樣器購(gòu)自美國(guó)BGI公司。

1.2 大氣PM2.5樣品采集

采集工作由大連市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心完成，采樣點(diǎn)位于大連市主城區(qū)，采樣裝置流量設(shè)定為1.13 m3·min-1。本實(shí)驗(yàn)中使用的PM2.5顆粒為11月采集獲得，采樣時(shí)間為24 h連續(xù)采樣，在空氣重污染期間加密采樣，采樣濾膜密封盒-20 ℃保存。

1.3 PM2.5 染毒懸液制備

制備方法參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，具體方法如下：將采樣濾膜按1 cm×1 cm剪裁，放入0 ℃預(yù)冷去離子水中超聲振蕩3次，每次20 min，收集洗脫液后用多層脫脂紗布過(guò)濾，再用 5 μm 微孔濾膜過(guò)濾，濾液4 ℃、 12 000 r·min-1離心 30 min，收集下層懸液冷凍過(guò)夜，真空冷凍干燥成干粉，稱量PM2.5干粉后用環(huán)氧乙烷滅菌，再加入無(wú)菌生理鹽水配制成 1 000 mg· mL-1的母液， -80 ℃避光保存?zhèn)溆谩?染毒前超聲振蕩使顆粒物充分混勻，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需工作液。

1.4 MTT 比色法檢測(cè)PM2.5對(duì)A549細(xì)胞活性的影響

將細(xì)胞消化、重懸并吹打成單個(gè)細(xì)胞后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整成1×104個(gè)·mL-1，按每孔200 μL細(xì)胞懸液接種到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后給藥。實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照組，溶劑對(duì)照組，不同濃度給藥組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。給藥24 h后，每孔加入20 μL噻唑藍(lán)溶液(MTT)后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸盡各孔培養(yǎng)液，每孔加入200 μL的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度值(OD值)，計(jì)算各組吸光度的平均值，按照下列公式計(jì)算細(xì)胞生存率：生存率%=(OD給藥組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%。

1.5 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上黏附的測(cè)定

用10 mg·L-1纖連蛋白(Fibronectin)，50 mg·L-1人工基底膜(Matrigel) 1:8稀釋液和10 g·L-1牛血清蛋白(BSA)作為基底膜包被96 孔板，BSA為對(duì)照基底，4 ℃過(guò)夜。加入含1% BSA的DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液 (50 μL·孔-1) 37 ℃孵育30 min水化基底膜。胰酶消化PM2.5處理24 h的A549細(xì)胞，計(jì)數(shù)并以1×105個(gè)·孔-1接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)1 h后，移去細(xì)胞懸浮液，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)輕洗3次，除去未貼壁細(xì)胞。按照MTT比色法測(cè)定各孔細(xì)胞在490 nm波長(zhǎng)處光吸收值(OD值)，以BSA對(duì)照基底膜OD值為參考，按公式分別計(jì)算細(xì)胞在Matrigel和Fibronectin上的黏附率：黏附率(%)=[(各組細(xì)胞OD值/BSA組細(xì)胞OD值)-1]×100% 。

1.6 Western blot 法測(cè)定PM2.5對(duì)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

接種A549細(xì)胞于6 孔板中，每孔 2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后給予PM2.5，繼續(xù)孵育24 h。提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，采用 BCA法測(cè)定蛋白濃度。向細(xì)胞裂解液中加入適當(dāng)體積的5×蛋白上樣緩沖液，混勻后置于沸水中5 min。根據(jù)蛋白濃度，按照 20 μg/樣品的總蛋白量計(jì)算電泳上樣量。選用6%的濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行蛋白電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。依據(jù)蛋白分子量的指示，按照目標(biāo)蛋白的分子量剪裁PVDF膜后放入用PBST配制的5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉 2 h。加入一抗稀釋液4 ℃孵育過(guò)夜，加入相應(yīng)二抗稀釋液室溫孵育2 h。采用化學(xué)法發(fā)光，使用Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)顯影。用Image J軟件分析發(fā)光得到蛋白條帶，記錄灰度值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

用記號(hào)筆在6孔板背后畫3條間隔均勻的直線作為定位線。將A549細(xì)胞按照每孔5×105個(gè)接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞均勻鋪滿培養(yǎng)孔底部后用100 μL的移液槍頭在細(xì)胞上劃痕，垂直于定位線。將劃痕與定位線的交點(diǎn)作為監(jiān)測(cè)點(diǎn)。用PBS洗凈漂浮細(xì)胞后加入含1%胎牛血清的培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下拍照記錄監(jiān)測(cè)點(diǎn)的劃痕寬度，作為0 h時(shí)間點(diǎn)記錄。給予相應(yīng)濃度的PM2.5，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后拍照記錄監(jiān)測(cè)點(diǎn)的劃痕寬度。用Image J軟件計(jì)算劃痕寬度，按照公式計(jì)算劃痕愈合率：劃痕愈合率%=[1-( 24 h劃痕寬度/ 0 h劃痕寬度)]×100%。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法具體如下[13]：將人工基底膜Matrigel按照1:8的比例與預(yù)冷DMEM混勻后按照每孔50 μL加入Transwell小室，使其均勻鋪滿小室底膜。將Transwell小室置于24孔板中，放入4 ℃冰箱過(guò)夜。于接種細(xì)胞前2 h將培養(yǎng)板從冰箱中取出，放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。將A549細(xì)胞按照每孔5×104接種于Transwell小室中。小室下部的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入含10 ng·mL-1的EGF，含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL。細(xì)胞接種6 h后給予相應(yīng)濃度的PM2.5，設(shè)置一個(gè)對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔，設(shè)置一組不加細(xì)胞的小室為空白對(duì)照孔。給PM2.5后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，取出Transwell小室，用4%多聚甲醛溶液固定15 min，待風(fēng)干后置于0.1%的結(jié)晶紫乙醇溶液中染色15 min。染色后用PBS漂洗Transwell小室，并用棉簽將小室底膜上部未穿膜細(xì)胞擦去，小室下部即為侵襲細(xì)胞。在顯微鏡下觀察后拍照，再將小室底膜浸入300 μL、33%的乙酸溶液中，使細(xì)胞中的結(jié)晶紫全部溶解于乙酸中。將溶解了結(jié)晶紫的乙酸溶液移入96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)乙酸溶液在570 nm波長(zhǎng)下的吸光值(OD)，將空白對(duì)照孔的吸光值作為背景在計(jì)算各組OD值時(shí)減去。

1.9 明膠酶譜法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9活性

給予A549細(xì)胞PM2.5后在無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM中培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)液上清，將上清液移入離心管中 2 000 r·min-1離心10 min， 測(cè)定上清蛋白濃度后與5×上樣緩沖液混合，配制含1%明膠的分離膠和不含明膠的濃縮膠，根據(jù)蛋白濃度確定上樣量，低溫電泳100 V 1.5 h；電泳結(jié)束后將凝膠置于洗脫液(2.5% Triton X-100，50 mmol·L-1Tris -HCl，5 mmol·L-1CaCl2，pH=7.6)中振蕩洗脫后用漂洗液(除不含Triton X-100外其余同洗脫液) 漂洗，接著將凝膠置于孵育液(50 mmol·L-1Tris - HCl, 10 mmol·L-1CaCl2, 0.02% Brij-35, pH7.6) 中37 ℃孵育42 h；孵育結(jié)束后經(jīng)染色液(0.05% 考馬斯亮藍(lán)、30%甲醇、10%乙酸) 染色3 h，以及脫色液A、B、C(甲醇濃度分別為30%、20%、10%，乙酸濃度分別為10%、10%、5%) 分別脫色0.5、1、2 h后，顯示出MMP-2(72 KD) 和MMP -9(92 KD)為位于藍(lán)色背景上的透亮帶，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析讀取條帶面積、寬度和灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同濃度 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

給予A549細(xì)胞不同濃度的PM2.5作用24 h后，MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率可以得出，細(xì)胞的存活率隨PM2.5濃度的增加而減少(見(jiàn)圖1)，當(dāng)PM2.5濃度大于等于12 μg· mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率與正常對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，利用軟件計(jì)算PM2.5對(duì)A549細(xì)胞的IC50為11 μg·mL-1。

2.2 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上黏附性的影響

PM2.5預(yù)處理細(xì)胞后，A549細(xì)胞與Matrigel和Fibronectin這2種基質(zhì)的黏附能力較正常對(duì)照組均有所增強(qiáng)(P<0.01)，結(jié)果如表1所示。

2.3 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移作用的影響

細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力的實(shí)驗(yàn)之一。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，細(xì)胞異常增強(qiáng)的遷移能力是腫瘤細(xì)胞穿越組織屏障的細(xì)胞生物基礎(chǔ)[14]。由于高濃度的PM2.5可明顯降低細(xì)胞存活率，因此為了排除PM2.5的細(xì)胞毒作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，我們根據(jù)之前實(shí)驗(yàn)測(cè)得的IC50值，選用10 μg·mL-1和 20 μg·mL-1為給藥濃度，并在以下實(shí)驗(yàn)中，均用該濃度給藥。為了避免細(xì)胞增殖對(duì)結(jié)果的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇含低濃度(1%)血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，并且選擇的時(shí)間點(diǎn)在細(xì)胞增殖周期以內(nèi)(24 h)。用不同濃度的PM2.5處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PM2.5可刺激A549細(xì)胞的遷移速率。如圖2所示，不同濃度的PM2.5明顯增加了細(xì)胞劃痕的愈合率，與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)。

圖1 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響Fig. 1 Effects of PM2.5 on the survival rate of A549 cells

組別Group與Matrigel的粘附率/%Adhesion rates with Matrigel/%與Fibronectin的粘附率/%Adhesion rates with Fibronectin/%正常對(duì)照組Control group24.6±3.323.1±2.5溶劑對(duì)照組Vehicle control group23.2±2.624.5±3.4低濃度PM2.5暴露組Low concentration PM2.5 exposure group37.1±3.5*35.2±2.2*高濃度PM2.5暴露組High concentration PM2.5 exposure group59.3±3.1*56.1±3.3*

注：*P<0.05與正常對(duì)照組對(duì)比。

Note:*P<0.05 compared with control group.

圖2 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移的影響注：A. 利用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的PM2.5處理A549細(xì)胞24 h后，劃痕的愈合情況照片；B. 測(cè)量劃痕寬度，按照公式計(jì)算劃痕愈合率：劃痕愈合率%=[1-( 24 h劃痕寬度/ 0 h劃痕寬度)]×100%。Fig. 2 Effects of PM2.5 on cell migration of A549 cellsNote：(A) Migration of cancer cell line A549 was assessed by wound-healing assay. A scratch wound was created on the cell surface and then PM2.5 were added. The cultures were photographed at 0 h and 24 h. (B) The cell wound closure rate was measured at 24 h and was calculated according to the equation: Wound closure% = [1 -(wound area at Tt / wound area at T0)] × 100%.

圖3 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響注：A. 用不同濃度的PM2.5處理A549細(xì)胞24 h后，進(jìn)入小室下膜的細(xì)胞結(jié)晶紫染色照片(100×)；a. 正常對(duì)照組，b. 溶劑對(duì)照組，c. 低濃度PM2.5暴露組，d. 高濃度PM2.5暴露組。B. 乙酸溶解小室下膜細(xì)胞中結(jié)晶紫后在570 nm波長(zhǎng)下的吸光值。*P<0.05與正常對(duì)照組對(duì)比。Fig. 3 Effect of PM2.5 on invasion of A549 cellsNote: A. Cells were treated with various concentrations of PM2.5 for 24 h, and cell invasion assay was performed. The invaded cells were photographed (100× magnification), a. control group, b. vehicle control group, c. low concentration PM2.5 exposure group, d. high concentration PM2.5 exposure group. *P<0.05 compared with control group.

2.4 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響

在腫瘤細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)中，腫瘤細(xì)胞被小室下部的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所驅(qū)動(dòng)，通過(guò)分泌基質(zhì)酶降解鋪在小室內(nèi)膜表面的基質(zhì)膠，從膜微孔中穿透后抵達(dá)小室下方。抵達(dá)小室下方的細(xì)胞數(shù)量反映了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PM2.5可增加A549細(xì)胞進(jìn)入小室下膜的細(xì)胞數(shù)量，提示其侵襲能力在PM2.5的作用下得到增強(qiáng)。如圖3所示。

2.5 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶活性的影響

上述研究表明，PM2.5對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力具有明顯的促進(jìn)效應(yīng)，而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是影響細(xì)胞侵襲能力的重要酶類，具有侵襲能力的腫瘤細(xì)胞均可分泌MMPs。為研究PM2.5對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響是否與MMPs的活性有關(guān)，我們利用明膠酶譜試驗(yàn)檢測(cè)了MMPs的2個(gè)亞型MMP-2和MMP-9的活性。腫瘤細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的活性與其侵襲能力密切相關(guān)，明膠是這2種酶的作用底物，通過(guò)酶譜法檢測(cè)樣本中MMP-2和MMP-9對(duì)明膠的分解效應(yīng)，可判斷其酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予A549細(xì)胞PM2.5處理24 h后，2個(gè)濃度組中細(xì)胞分泌的MMP-2和MMP-9活性均明顯增加，結(jié)果如圖3所示。

2.6 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

通過(guò)Westem blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。其中與細(xì)胞侵襲相關(guān)的蛋白MMP-2、MMP-9表達(dá)明顯增加，而細(xì)胞黏附蛋白E-cadherin表達(dá)量下降，N-cadherin的表達(dá)量升高，如圖4所示。

3 討論(Discussion)

國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)研究顯示PM2.5暴露水平與肺癌的發(fā)病率及病死率呈正相關(guān)[15-17]，PM2.5導(dǎo)致肺癌發(fā)生和發(fā)展的病理生理機(jī)制也得到了實(shí)驗(yàn)性研究結(jié)論的初步闡明。PM2.5的化學(xué)組分中，重金屬、多環(huán)芳香烴等成分已被證實(shí)與肺癌的發(fā)生有確切的因果關(guān)系，這些物質(zhì)可通過(guò)損傷免疫系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、抑制DNA修復(fù)和增加DNA突變率等多種途徑誘發(fā)肺癌。腫瘤轉(zhuǎn)移是影響肺癌患者預(yù)后的重要因素，關(guān)于PM2.5促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移的研究報(bào)道較少，吳鴻章等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露能通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、MMP-9與低氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α)基因的表達(dá)，促進(jìn)肺癌移植瘤新生血管形成。腫瘤轉(zhuǎn)移是多因素、多步驟的生物學(xué)過(guò)程，細(xì)胞的遷移、黏附和侵襲是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵步驟，我們通過(guò)細(xì)胞-基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)研究了大氣來(lái)源的PM2.5對(duì)這3個(gè)關(guān)鍵步驟的影響。由于較高濃度的PM2.5可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的活性，因此我們根據(jù)MTT比色實(shí)驗(yàn)獲得的IC50選用較低的給藥濃度以排除PM2.5對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種體外檢測(cè)細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力的實(shí)驗(yàn)，腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力與其轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[18]，我們發(fā)現(xiàn)PM2.5可明顯增加A549細(xì)胞劃痕的愈合速率，說(shuō)明細(xì)胞的遷移能力受到了影響，腫瘤的轉(zhuǎn)移潛力可能增強(qiáng)。高侵襲的腫瘤細(xì)胞與基底膜成分的異質(zhì)性黏附能力通常增高，而腫瘤細(xì)胞間的同質(zhì)性黏附能力則會(huì)下降。這有利于腫瘤細(xì)胞與腫瘤母體分離，并侵犯基底膜等正常組織。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PM2.5能增加A549細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)Matrigel和Fibronectin的黏附率，細(xì)胞間黏附蛋白E-cadherin表達(dá)下降，而細(xì)胞-基質(zhì)黏附蛋白N-cadherin表達(dá)升高初步揭示了PM2.5影響A549細(xì)胞-基質(zhì)黏附作用的機(jī)制。E-cadherin表達(dá)下降，N-cadherin表達(dá)升高也是腫瘤細(xì)胞從上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的重要表型，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)EMT獲得遷移和侵襲能力[19]。研究發(fā)現(xiàn)，香煙提取物可通過(guò)激活Rac1/Smad2和Rac1/PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)EMT的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)移潛能增強(qiáng)[20]，本實(shí)驗(yàn)表明：大氣來(lái)源的PM2.5同樣具備該效應(yīng)。

圖4 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9和MMP-2活性的影響Fig. 4 Effect of PM2.5 on activities of MMP-2 and MMP-9 in A549 cells

圖5 PM2.5對(duì)A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of PM2.5 on the expression of metastasis associated proteins in A549 cells

隨后，我們研究了PM2.5對(duì)A549細(xì)胞穿透基質(zhì)膠能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PM2.5處理后，可穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，說(shuō)明PM2.5可明顯增加細(xì)胞的侵襲能力。由于A549細(xì)胞的侵襲能力與其分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)相關(guān)，我們利用明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了PM2.5對(duì)A549細(xì)胞培養(yǎng)液中MMPs的活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9活力在PM2.5作用后均明顯增強(qiáng)。Western blot 結(jié)果顯示細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)量也明顯升高，說(shuō)明這2種基質(zhì)金屬蛋白酶活力增強(qiáng)可能與其蛋白表達(dá)量升高有關(guān)。

綜上所述，高濃度的PM2.5具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，而較低濃度的PM2.5可促進(jìn)細(xì)胞-基質(zhì)黏附、增加細(xì)胞遷移速率和侵襲能力。該結(jié)果提示PM2.5可能通過(guò)增強(qiáng)上述細(xì)胞生物學(xué)作用促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移，但本實(shí)驗(yàn)僅是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)且PM2.5樣本來(lái)源有限，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定局限性，該效應(yīng)及其機(jī)制還有待進(jìn)一步體內(nèi)研究證實(shí)和深入。

通訊作者簡(jiǎn)介：王曉波(1961-)，男，藥學(xué)博士，主任藥師，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樾滤幯邪l(fā)、藥物分析，發(fā)表學(xué)術(shù)論文200余篇。

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