丙烯腈暴露對(duì)大鼠腦組織損傷及iNOS/p38 MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

羅波艷, 張瑞萍, 王珂, 魏琳顏, 趙粉線, 薛紅麗, 李芝蘭,*

1. 蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院, 蘭州 730000 2. 寶雞市疾病預(yù)防控制中心，寶雞 721006

丙烯腈(acrylonitrile，ACN)是一種被廣泛用于工業(yè)、高分子材料及生活日用品等方面的生產(chǎn)原料。國(guó)際癌癥組織(IARC)已于1999年將ACN的致癌性歸為2B類，即為“可能致癌物”[1]。大量研究表明，ACN可對(duì)機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)造成損傷，其中神經(jīng)系統(tǒng)毒性是ACN毒作用出現(xiàn)最早、最為突出的毒性表現(xiàn)之一[2-4]。

作為細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種重要物質(zhì)，一氧化氮(nitric oxide，NO)可參與機(jī)體各種生理、病理過程。有研究報(bào)道，NO代謝水平變化與帕金森等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生相關(guān)[5-6]，且過量的NO可使神經(jīng)系統(tǒng)誘發(fā)癲癇，引發(fā)腦損傷和記憶缺損等[7]。體內(nèi)NO含量受一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)水平的調(diào)控。NOS又包括內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)和誘導(dǎo)型/免疫型一氧化氮合酶(inducible or immunological nitric oxide synthase，iNOS)3種，其中iNOS主要作為神經(jīng)遞質(zhì)與神經(jīng)調(diào)質(zhì)，參與信息傳遞[8]，eNOS和nNOS負(fù)責(zé)維持體內(nèi)正常生理水平的NO生成[9]。當(dāng)機(jī)體受到炎癥、免疫微生物等刺激時(shí)，會(huì)激活iNOS在巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等細(xì)胞上的表達(dá)，繼而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生和釋放大量NO[10]，導(dǎo)致組織損傷和發(fā)生細(xì)胞凋亡[11]。因此，iNOS/NO含量的高低對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的功能正常與否起著重要的作用。此外，p38 MAPK信號(hào)通路在MAPK信號(hào)通路中扮演著非常重要的角色，其在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[12]。

有研究結(jié)果顯示，N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)可以干預(yù)ACN對(duì)神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)的損傷[13]。因此，本研究擬用不同劑量ACN對(duì)雄性SD大鼠進(jìn)行灌胃染毒，檢測(cè)腦組織NO含量及iNOS和p38 MAPK蛋白表達(dá)，同時(shí)設(shè)立NAC干預(yù)組，觀察NAC對(duì)ACN產(chǎn)生的大鼠腦組織毒性作用的干預(yù)作用，以期為ACN誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)系統(tǒng)毒性機(jī)制深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的50只SPF級(jí)成年健康雄性SD大鼠(動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(甘)2011-0001)，體重250～300 g，全程飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(設(shè)施合格證號(hào)：SYXK(甘)2011-0001)。實(shí)驗(yàn)室晝夜交替照明，溫度為(22±1) ℃，濕度為50%。大鼠可自由攝食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將大鼠隨機(jī)分為5組，分別以低(12.5 mg·kg-1)、中(25.0 mg·kg-1)、高(50.0 mg·kg-1)劑量ACN對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃染毒，對(duì)照組大鼠用玉米油進(jìn)行灌胃，另設(shè)NAC干預(yù)組，即先用300.0 mg·kg-1NAC給大鼠進(jìn)行灌胃，30 min后再用50.0 mg·kg-1ACN對(duì)大鼠灌胃染毒，1次·天-1，6天·周-1，共連續(xù)灌胃染毒13周。末次染毒結(jié)束后，次日心臟采血后處死大鼠。

1.2 藥物及試劑

ACN(純度>99%)購(gòu)買于天津四通化工廠，NAC購(gòu)買于美國(guó)Amersco公司，NO和NOS試劑盒購(gòu)買于南京建成生物工程研究所，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)購(gòu)買于上海碧云天生物有限公司，iNOS購(gòu)買于武漢Proteintech公司，eNOS、nNOS購(gòu)買于美國(guó)SAB公司。β-Tublin、HRP標(biāo)記山羊抗兔/抗鼠購(gòu)買于武漢伊萊瑞特公司，p-p38和p38購(gòu)買于美國(guó)CST公司。低溫高速離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN COULTER公司)，可見光分光光度計(jì)(上海精科有限公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek公司)，電泳、轉(zhuǎn)膜和凝膠成像曝光儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.3 臟器系數(shù)測(cè)定

末次染毒結(jié)束后，次日對(duì)大鼠進(jìn)行稱重，測(cè)量3次，求取大鼠的平均體重值。心臟采血后處死大鼠，將腦組織置于盛有0.86%生理鹽水的玻璃平皿中進(jìn)行沖洗，干凈后用濾紙拭干，稱量3次，求取大鼠的腦組織平均濕重。用腦組織平均濕重和大鼠平均體重計(jì)算臟器系數(shù)(臟器系數(shù)(%)=臟器濕重(g)/ 體重(g)×100%) 。

1.4 NO含量及總NOS水平的測(cè)定

嚴(yán)格按照南京建成NO和總NOS測(cè)定試劑盒說明書的檢測(cè)要求，對(duì)腦組織中NO含量和總NOS水平進(jìn)行檢測(cè)。并用碧云天BCA蛋白濃度測(cè)定法對(duì)大鼠腦組織蛋白含量進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.5 iNOS、eNOS、nNOS和p38、p-p38蛋白Western blot測(cè)定

從-80 ℃冰箱取出凍存的大鼠腦組織，按腦濕重(mg)與RIPA體積(μL)比為1:10的比例加入適量的高效RIPA裂解液，并按RIPA體積與PMSF體積比為100:1準(zhǔn)確吸取PMSF，在冰水浴中對(duì)其進(jìn)行充分研磨，然后置于EP管中予以標(biāo)記。檢測(cè)磷酸化蛋白時(shí)，在研磨前按磷酸酶抑制劑體積與RIPA裂解液體積比為1:100的比例，準(zhǔn)確加入磷酸酶抑制劑。以4 ℃、12 000 g·min-1對(duì)腦勻漿進(jìn)行離心，離心15 min。吸取上清，分裝20 μL上清液用于BCA法測(cè)定蛋白含量，剩余上清液按每管100 μL分裝至EP管，加入適量的RIPA裂解液和5×上樣緩沖液，封口、標(biāo)記后將EP管置于沸水中持續(xù)煮沸5 min，使腦組織蛋白樣品充分變性。然后按每條泳道蛋白含量為60μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)彩虹蛋白Marker標(biāo)識(shí)的位置，將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉2 h，然后分別加入iNOS(兔抗，1：400)、eNOS(鼠抗，1:500)、nNOS(兔抗，1:1 000)、β-Tublin(兔抗，1:1 000)、p38(鼠抗，1:1 000)、p-p38(兔抗，1：500)，室溫孵育過夜，然后選擇對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的抗兔/抗鼠二抗，孵育2 h。最后加入適量ECL發(fā)光液，用凝膠成像儀進(jìn)行曝光，保存條帶。采用Image J圖像分析軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果(Results)

2.1 ACN對(duì)大鼠體重和腦組織濕重及臟器系數(shù)的影響

從染毒第6周開始，觀察到ACN各劑量組大鼠開始出現(xiàn)躁動(dòng)、易激怒、輕度流涎等表現(xiàn)。單因素方差分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高劑量組大鼠腦濕重顯著降低(P<0.05)。各劑量組大鼠體重與對(duì)照組相比較均升高，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.847，P=0.159)。隨著ACN染毒劑量增加，大鼠腦臟器系數(shù)逐漸降低(F=3.427，P=0.027)，且ACN各劑量組腦臟器系數(shù)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。經(jīng)NAC干預(yù)后，NAC組大鼠腦濕重、體重及臟器系數(shù)與高劑量組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果詳見表1。

2.2 ACN對(duì)大鼠腦組織NO含量和總NOS水平的影響

隨著ACN染毒劑量增加，大鼠腦組織NO含量和總NOS活力均不斷上升(F=8.528，P=0.000；F=3.422，P=0.028)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量組大鼠腦組織NO含量顯著高于對(duì)照組和低劑量組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，ACN各劑量組大鼠腦組織總NOS活力均顯著升高(P<0.05)。經(jīng)NAC干預(yù)后，與NAC組相比，高劑量組大鼠腦組織NO含量降低，總NOS水平升高，但其差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表1 丙烯腈(ACN)慢性染毒對(duì)大鼠腦組織、體重及腦臟器系數(shù)的影響Table 1 Effects of the chronic exposure of acrylonitrile (ACN) on brain tissues, body weights and the relative organ weights of the brain tissues in rats (n=5,

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05; NAC為N-乙酰半胱氨酸。

Note: Compared with control group,*P<0.05; NAC stands for N-acetylcysteine.

2.3 ACN對(duì)iNOS、nNOS和eNOS蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高劑量組大鼠腦組織iNOS蛋白和nNOS蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，eNOS蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。經(jīng)NAC干預(yù)后，與高劑量組比較，NAC組大鼠腦iNOS蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，eNOS蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，nNOS蛋白表達(dá)水平升高(P>0.05)。結(jié)果詳見表3和圖1-A。

2.4 ACN對(duì)大鼠腦組織p38蛋白及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高劑量組大鼠腦組織p-p38蛋白和p38蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，且p-p38/p38比值也顯著升高(P<0.05)。經(jīng)NAC干預(yù)后，與高劑量組比較，NAC組大鼠腦組織p-p38和p38蛋白表達(dá)水平及p-p38/p38比值均顯著降低(P<0.05)。結(jié)果詳見表4、圖1-B。

表2 ACN慢性染毒對(duì)大鼠腦組織NO含量和總NOS活力的影響Table 2 Effects of the chronic exposure of acrylonitrile (ACN) on the contents of NO and the activities of total nitric oxide synthase (tNOS) in rats brain tissues

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

Note: Compared with control group,*P<0.05.

表3 ACN慢性染毒對(duì)大鼠腦組織NOS各亞型蛋白表達(dá)水平的影響Table 3 Effects of the chronic exposure of ACN on the protein expression level of three subtypes of NOS in rats brain tissues

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與NAC組比較，#P<0.05。

Note: Compared with control group,*P<0.05; compared with NAC group,#P<0.05.

表4 ACN慢性染毒對(duì)大鼠腦組織p38蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)水平的影響Table 4 Effects of the chronic exposure of ACN on the protein expression level of p38 and p-p38 proteins in rats brain tissues

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與NAC組比較，#P<0.05。

Note: Compared with control group,*P<0.05; compared with NAC group,#P<0.05.

圖1 ACN慢性染毒對(duì)大鼠腦組織NOS亞型蛋白及p38、p-p38蛋白變化的免疫印跡分析Fig. 1 Effects of the chronic exposure of ACN on the immunoblotting analysis of change of three subtypes of NOS, p38 and p-p38 proteins in rats brain tissues

3 討論(Discussion)

臟器系數(shù)不僅可以反映化學(xué)毒物對(duì)機(jī)體的亞慢性毒性效應(yīng)以及對(duì)臟器的綜合毒性，而且可提供尋找毒物作用的靶器官的線索，對(duì)評(píng)價(jià)外源化學(xué)物的毒性具有靈敏性、有效性、經(jīng)濟(jì)性[14]。本實(shí)驗(yàn)中，ACN低、中、高劑量組大鼠腦臟器系數(shù)均顯著低于對(duì)照組，說明ACN對(duì)大鼠腦組織產(chǎn)生了慢性毒作用，這可能與腦組織是ACN毒作用的靶器官有關(guān)。有研究認(rèn)為機(jī)體組織臟器系數(shù)降低，提示該組織可能出現(xiàn)了臟器萎縮、退行性變化[15]。本研究結(jié)果提示ACN灌胃染毒13周對(duì)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生了慢性毒作用，腦組織出現(xiàn)了萎縮和退行性變化。

NO是一種極不穩(wěn)定的生物自由基，可快速通過生物膜進(jìn)行擴(kuò)散。雖然NO對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持是必需的，其在突觸可塑性、神經(jīng)調(diào)節(jié)和其他生理作用中也是不可替代的，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，但NO含量升高，會(huì)與超氧陰離子結(jié)合，形成高活性和高毒性的過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)[16]，引起氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷[17]，加之ONOO-不僅是一種強(qiáng)有力的酪氨酸硝化劑[18]，可能會(huì)導(dǎo)致抗氧化酶的亞硝基化[19]，而且還是NO的主要毒作用形式[20]，ONOO-可與H+形成ONOOH，繼而分解產(chǎn)生的羥基自由基(·OH)可進(jìn)一步通過損傷線粒體電子傳遞系統(tǒng)，對(duì)特定組織造成一定的損傷[8]。在本研究中，ACN高劑量組大鼠腦組織nNOS和iNOS蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，eNOS蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組。同時(shí)隨著ACN染毒劑量增加，大鼠腦組織tNOS水平和NO含量也均不斷升高。說明ACN可以誘導(dǎo)大鼠腦組織nNOS和eNOS蛋白表達(dá)水平改變，并刺激炎性細(xì)胞開始釋放iNOS，使iNOS水平升高，繼而使tNOS水平升高，引起NO含量增加，導(dǎo)致腦組織產(chǎn)生的ONOO-生成增加，最終引起腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷。NAC是氨基酸L-半胱氨酸和GSH的乙酰化前體物質(zhì)，可以對(duì)抗氧化作用和氧化代謝過程。對(duì)NAC開展的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和人群研究均表明它可以通過減少細(xì)胞外胱氨酸到半胱氨酸的轉(zhuǎn)化，或者可作為一種細(xì)胞內(nèi)的巰基來源，使其成為一種強(qiáng)大的抗氧化劑[21]。此外，它還可以通過增強(qiáng)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性，加之其自身也是一個(gè)強(qiáng)大的親核體，可以清除體內(nèi)大量的自由基[22]。與高劑量組比較，NAC組大鼠腦組織tNOS水平降低，其中iNOS蛋白表達(dá)水平顯著降低，eNOS表達(dá)水平顯著升高，nNOS蛋白表達(dá)水平降低，表明NAC可以干預(yù)ACN引起的大鼠腦組織炎性細(xì)胞釋放iNOS，使iNOS水平降低，進(jìn)而使腦組織tNOS水平降低，提示NAC可以通過降低ACN染毒大鼠腦組織ONOO-、·OH等氧化物質(zhì)的水平來介導(dǎo)iNOS等蛋白表達(dá)水平的改變。但NAC組大鼠腦組織中NO含量與高劑量組比較升高，這可能是由于ACN染毒可引起大鼠腦組織ONOO-、·OH等自由基大量生成，加上NO本身也是一種自由基，導(dǎo)致300.0 mg·kg-1NAC不能完全對(duì)抗50.0 mg·kg-1ACN引起的腦組織損傷。

p38 MAPK信號(hào)通路是MAPKs家族中重要的一員，其激活途徑在不同細(xì)胞中有所不同，且取決于其生理或應(yīng)激水平。當(dāng)脂多糖、NO等炎性刺激源出現(xiàn)，可刺激中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞激活p38，活化后的p38進(jìn)入細(xì)胞核，引起細(xì)胞核內(nèi)NF-κB等相關(guān)因子磷酸化并過度表達(dá)，繼而使多形核白細(xì)胞出現(xiàn)粘附和聚集現(xiàn)象，最終導(dǎo)致組織出現(xiàn)炎癥損傷反應(yīng)[23]。本實(shí)驗(yàn)中，ACN高劑量組p-p38和p38蛋白表達(dá)水平及p-p38/p38比值均顯著高于對(duì)照組和NAC組，這些結(jié)果表明ACN慢性染毒可引起大鼠腦組織p-p38 蛋白表達(dá)水平升高，進(jìn)而激活p38 MAPK信號(hào)通路，且NAC對(duì)ACN誘導(dǎo)激活的p38 MAPK信號(hào)通路具有一定的抑制作用。這可能與腦組織NO含量生成增加，使ONOO-生成增加，引起腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激，引起位于p38 MAPK信號(hào)通路上游的daf-16激活，進(jìn)而調(diào)控DAF-16進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而激活p38 MAPK信號(hào)通路有關(guān)[24]。同時(shí)NAC可以通過對(duì)抗體內(nèi)ONOO-等氧化物質(zhì)水平的升高而抑制p38 MAPK信號(hào)通路的激活。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件下，ACN慢性染毒可引起大鼠腦組織iNOS表達(dá)水平升高，NO含量增加，并激活p38 MAPK信號(hào)通路，這可能是ACN引起中樞神經(jīng)毒性作用的機(jī)制之一?？寡趸瘎㎞AC通過降低ACN誘導(dǎo)的腦組織氧化應(yīng)激水平從而抑制iNOS/p38 MAPK信號(hào)通路的活化，提示活性氧(ROS)可能參與iNOS/p38 MAPK信號(hào)通路的活化過程，但有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

通訊作者簡(jiǎn)介：李芝蘭(1962—)，女，碩士研究生導(dǎo)師，教授，蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院兒少衛(wèi)生與婦幼保健學(xué)研究所所長(zhǎng)，研究方向?yàn)閶D女勞動(dòng)衛(wèi)生與生殖健康。

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