白樺脂酸與紅棗總?cè)扑釋?duì)小鼠酒精肝損傷的保護(hù)作用

蔡天嬌，王瑞珍，魏君慧，薛 媛，雷宏杰*，徐懷德*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

紅棗為鼠李科棗屬植物的成熟果實(shí)，我國(guó)棗樹種植面積已接近300萬(wàn) hm2，原棗年產(chǎn)量超過800萬(wàn) t，占世界棗樹種植面積和產(chǎn)量的98%以上。紅棗是一種藥食同源的食品，傳統(tǒng)中醫(yī)藥認(rèn)為紅棗具有保肝護(hù)肝、補(bǔ)血益氣、養(yǎng)胃健脾等功能[1]。紅棗不僅含有豐富的糖類、礦物質(zhì)元素、VC等營(yíng)養(yǎng)成分[2]，還含有多酚、黃酮、環(huán)磷酸腺苷以及三萜等多種生物活性成分[3-4]。紅棗三萜類化合物中熊果酸、齊墩果酸、白樺脂酸（betulinic acid，BA）等較為典型[5]，相關(guān)研究多集中在提取[6]與含量分析[7-8]方面，且對(duì)于大多數(shù)棗品種，白樺脂酸含量較高[9]。

酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，包括酒精代謝產(chǎn)物引起的損傷、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化等[10-11]，已有研究表明北五味子木脂素[12]、靈芝三萜酸[13]及石斛多糖[14]等多種中藥提取物對(duì)酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。三萜類化合物是一種重要的中藥化學(xué)成分，其中熊果酸可通過抑制TGF-β1與其受體的結(jié)合或降低TGF-β1表達(dá)有效阻止酒精引起的肝纖維化[15]，齊墩果酸可通過干預(yù)酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激等多種機(jī)制有效干預(yù)酒精性肝損傷[16-17]，白樺脂醇作為BA的前體物質(zhì)也被證明對(duì)酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用[18]，而關(guān)于BA的研究多集中于消炎[19-20]、抗癌[21-22]等方面；汪佰莉等[23]探討了BA在急性免疫性肝損傷中的作用及對(duì)細(xì)胞因子和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、activated-Caspase-3表達(dá)的影響，通過肝臟細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明BA對(duì)小鼠急性免疫性肝損傷具有一定拮抗作用。但BA和紅棗總?cè)扑幔╰otal triterpenic acids from red jujube，JTTA）保肝作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究鮮見報(bào)道。

為此，本研究采用酒精性肝損傷小鼠模型，分析其肝臟指數(shù)、肝臟病理學(xué)與生化指標(biāo)，探討B(tài)A與JTTA對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，為紅棗中三萜酸的進(jìn)一步開發(fā)與研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)雄性昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度（55±5）%下飼養(yǎng)，控制照明時(shí)間為每天12 h，給予標(biāo)準(zhǔn)普通飼料和充足的飲用水，自由進(jìn)食與飲水。

紅棗采自陜西清澗，經(jīng)烘箱50 ℃烘干，粉碎過40 目篩。

白樺脂酸（色譜級(jí)，純度≥98%） 南京春秋生物工程有限公司；水飛薊素膠囊 德國(guó)馬博士大藥廠；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、肝臟谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒 南京建成生物工程研究所；羧甲基纖維素鈉 國(guó)藥集團(tuán)；二鍋頭白酒 北京紅星股份有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1780紫外-可見分光度儀 日本島津公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；7180型全自動(dòng)生化分析儀 日本日立公司；FA1004電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；HH-8水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；E100生物顯微鏡日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 紅棗總?cè)扑岬闹苽?/p>

稱取一定量紅棗粉，先進(jìn)行纖維素酶酶解，酶解條件為：加酶量1.5 mg/g，酶解時(shí)間40 min，酶解溫度60 ℃，酶解pH 4.5，然后進(jìn)行超聲波輔助提取，提取條件：以80%乙醇為提取溶劑，料液比1∶25（m/V），50 ℃、400 W超聲處理20 min，重復(fù)提取2 次，過濾。濾液合并后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成浸膏狀，將浸膏用蒸餾水分散，調(diào)pH值為4，以氯仿為萃取劑，采取兩相萃取法萃取，氯仿層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥、蒸餾水分散后用D101大孔樹脂純化。純化條件：上樣pH 7，上樣體積為7 BV，洗脫劑為95%乙醇，洗脫劑pH 11，洗脫劑體積5 BV。洗脫液蒸干后得微黃色紅棗總?cè)扑峒兓?，采用紫?可見分光光度法，在550 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，其純度可達(dá)78%。

1.3.2 小鼠酒精性肝損傷模型的建立

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、BA低（25 mg/kg）、中（50 mg/kg）、高（100 mg/kg）劑量組、JTTA組（50 mg/kg）和水飛薊素陽(yáng)性對(duì)照組（50 mg/kg），每組12 只。各給藥組每天灌胃給藥一次，正常對(duì)照和模型組給予等量溶媒（0.5%羧甲基纖維素鈉溶液），連續(xù)6 周。小鼠每周稱質(zhì)量2 次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量。模型組和各給藥組于第3周開始，灌胃給予二鍋頭白酒配制的30%乙醇。正常對(duì)照組給予等量溶劑。各給藥組在灌胃給藥間隔4 h以上再給予乙醇，連續(xù)4 周。

1.3.3 樣品的采集與處理

于末次灌胃后，各組小鼠禁食不禁水16 h后，對(duì)各組小鼠稱質(zhì)量，摘眼球取血，收集血液，放置30 min，4 000 r/min離心15 min，分離血清于1.5 mL離心管中，4 ℃保存。小鼠頸椎脫臼處死后解剖取肝臟，用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水沖凈表面浮血，濾紙拭干，稱質(zhì)量，剪取肝左葉組織浸入4%多聚甲醛中固定，制作石蠟切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，并于光學(xué)顯微鏡下檢查組織病理學(xué)變化；剪取剩余部分肝組織，用預(yù)冷生理鹽水沖洗并制備10%肝臟組織勻漿。

1.3.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.4.1 一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠的體質(zhì)量變化、進(jìn)食、毛發(fā)、狀態(tài)、行為及死亡情況。

1.3.4.2 小鼠肝臟指數(shù)測(cè)定

小鼠肝臟指數(shù)根據(jù)下式計(jì)算。

1.3.4.3 肝臟病理學(xué)檢查

于400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察肝細(xì)胞的形態(tài)變化、炎癥反應(yīng)、纖維化、脂肪空泡等病理改變。

1.3.4.4 生化指標(biāo)的檢測(cè)

采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活力等肝功能指標(biāo)與血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）濃度等脂肪代謝指標(biāo)；按照試劑盒說明書進(jìn)行肝勻漿MDA含量、GSH-Px、SOD活力等肝臟抗氧化能力指標(biāo)測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，采用Minitab 16.2.3軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 BA、JTTA對(duì)酒精性肝損傷小鼠體質(zhì)量的影響

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，正常對(duì)照組小鼠狀況良好，飲食排泄均正常，體質(zhì)量逐漸增加，無(wú)死亡現(xiàn)象。在乙醇灌胃期間，模型組、BA組、JTTA組小鼠及陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)不同程度的異常情況。尤其是模型組小鼠行動(dòng)遲緩、毛發(fā)凌亂、光澤度差，個(gè)別有脫毛現(xiàn)象，各劑量組和水飛薊素組小鼠狀態(tài)各有不同程度的改善。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化曲線Fig. 1 Body weight change in mice from different groups

各組小鼠體質(zhì)量變化情況如圖1所示，灌胃酒精前，各組小鼠體質(zhì)量均正常增長(zhǎng)，且組間差異不顯著，第3周開始灌胃酒精后，模型組與對(duì)照組相比，小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速率明顯減慢，灌胃后期小鼠體質(zhì)量基本不再增長(zhǎng)甚至呈下降趨勢(shì)，且在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組小鼠體質(zhì)量明顯低于正常組。給藥組與模型組相比，小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況均有改善。

2.2 BA、JTTA對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響

由圖2可知，模型組小鼠的肝臟指數(shù)與對(duì)照組相比，肝臟指數(shù)升高了7.01%，差異顯著（P＜0.05），說明酒精灌胃能夠使小鼠發(fā)生肝腫脹現(xiàn)象，使肝臟指數(shù)升高；與模型組相比，水飛薊素組、JTTA組及BA低、中、高劑量組小鼠肝臟指數(shù)均有所降低，其中JTTA組效果最為顯著，達(dá)到了正常對(duì)照組水平，不同劑量BA處理組之間并沒有顯著性差異。

圖2 BA、JTTA對(duì)小鼠肝臟指數(shù)的影響Fig. 2 Effects of BA and JTTA on liver index

2.3 BA、JTTA對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟病理組織的影響

圖3 BA、JTTA對(duì)小鼠肝臟組織病理?yè)p傷的影響（×400）Fig. 3 Effects of BA and JTTA on pathological liver injury (× 400)

HE染色光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索以小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉內(nèi)網(wǎng)狀纖維支架結(jié)構(gòu)完整，分布規(guī)律，匯管區(qū)及其周圍無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞無(wú)明顯的脂肪變性、水腫、壞死等，排列整齊。模型組小鼠肝組織病理?yè)p傷嚴(yán)重，肝細(xì)胞明顯腫脹，可見大小不一、數(shù)量不等的脂滴并伴有氣球樣變以及細(xì)胞水腫；肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝索排列不規(guī)則。低劑量組與模型組相比，小鼠肝細(xì)胞氣球樣變及細(xì)胞水腫情況有所改善，但肝小葉結(jié)構(gòu)仍然混亂。中、高劑量BA干預(yù)后，小鼠肝臟脂肪變性得到改善，肝臟排列較為整齊，組織結(jié)構(gòu)趨于正常。而JTTA干預(yù)后，小鼠肝組織病理?yè)p傷也得到明顯改善，肝小葉結(jié)構(gòu)也趨于完整。水飛薊素組小鼠肝細(xì)胞、肝小葉結(jié)構(gòu)也基本正常。

2.4 BA、JTTA對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝功能的影響

ALT和AST均為非特異性細(xì)胞內(nèi)功能酶，是臨床上常用的肝功能評(píng)價(jià)指標(biāo)[24]。正常時(shí)其在血清中的含量很低，當(dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)，血清中ALT和AST活力會(huì)隨之發(fā)生變化，所以ALT與AST活力的高低可以在一定范圍內(nèi)反映生物體內(nèi)肝細(xì)胞的損傷程度[25]。

圖4 BA、JTTA對(duì)小鼠血清ALT（A）、AST（B）活力的影響Fig. 4 Effects of BA and JTTA on ALT (A) and AST (B) activities in serum

由圖4可知，同對(duì)照組比較，模型組小鼠血清的ALT、AST活力分別增加了78.58%、38.65%，顯著性升高（P＜0.05），說明成功建立模型。不同劑量BA、JTTA及水飛薊素處理后，小鼠血清的ALT、AST活力均顯著降低（P＜0.05），且BA高劑量組、JTTA、水飛薊素處理組小鼠血清的ALT、AST活力已基本達(dá)到正常水平。

2.5 BA、JTTA對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟脂肪代謝的影響

肝臟發(fā)生脂肪性病變時(shí)，脂肪代謝能力下降，導(dǎo)致血液中TG、TC濃度上升[26]。HDL-C、LDL-C則與膽固醇在體內(nèi)的運(yùn)輸密切相關(guān)，濃度會(huì)隨著血液中TG、TC濃度的變化而改變[27]。

由表1可知，模型組小鼠血清的TG、TC濃度均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05)，各樣品處理組與模型組相比，小鼠血清的TG、TC濃度顯著降低（P＜0.05)，BA低、中、高處理組小鼠血清的TG濃度分別下降了17.99%、28.04%和28.57%，小鼠血清的TC濃度分別下降了8.31%、12.23%、16.15%，表現(xiàn)出一定的劑量依賴型，JTTA對(duì)TG、TC濃度也表現(xiàn)出了明顯的抑制作用。且同對(duì)照組相比，模型組小鼠血清的HDL-C濃度明顯下降，LDL-C濃度顯著上升。BA不同劑量處理組、JTTA組及水飛薊素組小鼠血清的HDL-C水平均有不同程度升高，LDL-C濃度則有不同程度的降低，但不同劑量白樺脂酸處理組之間并沒有表現(xiàn)出顯著性差異，不具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

表1 BA、JTTA對(duì)小鼠血清TG、TC、HDL-C及LDL-C濃度的影響Table 1 Effects of BA and JTTA on TG, TC, HDL-C and LDL-C levels in serum mmol/L

2.6 BA、JTTA對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟抗氧化能力的影響

小鼠在酒精連續(xù)灌胃4 周后，機(jī)體內(nèi)乙醇代謝引發(fā)多種氧化應(yīng)激反應(yīng)，模型組小鼠肝臟過氧化物的含量明顯升高，抗氧化能力明顯降低，而不同劑量BA處理組、JTTA組及水飛薊素組小鼠肝臟抗氧化能力有所改善。

表2 BA、JTTA對(duì)小鼠肝臟GSH-Px、SOD活力及MDA含量的影響Table 2 Effects of BA and JTTA on GSH-Px and SOD activities and MDA content in liver

由表2可知，模型組小鼠肝臟GSH-Px、SOD活力與對(duì)照組相比，顯著下降（P＜0.05）。BA低、中、高劑量處理組與模型組相比，GSH-Px活力分別提高了2.73%、35.52%、56.69%，SOD活力分別提高了3.91%、13.86%、25.45%，均表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，且高劑量組GSH-Px、SOD活力接近正常水平，JTTA組GSH-Px、SOD活力則分別提高了47.85%、19.71%，與對(duì)照組相比也無(wú)顯著性差異。

MDA作為脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物[28]是反映組織損傷時(shí)出現(xiàn)的過強(qiáng)氧化作用的指標(biāo)之一，組織中MDA含量越高，氧化活性越強(qiáng)，組織受損程度越大[29-30]。由表2可知，模型組與對(duì)照組相比，小鼠肝臟MDA含量上升了27.53%，差異顯著（P＜0.05），BA低、中、高劑量處理組與模型組相比，小鼠肝臟MDA含量分別降低了6.51%、19.25%、19.88%，中、高劑量組之間并沒有顯著性差異，JTTA組與模型組相比，小鼠肝臟MDA含量則下降了9.34%。

3 結(jié) 論

BA低、中、高劑量處理組與模型組相比，小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況有所改善，肝臟指數(shù)及肝組織結(jié)構(gòu)病理?yè)p傷程度明顯降低，血清中ALT、AST活力顯著降低，表示肝功能得到一定改善；血清中TG、TC、LDL-C濃度顯著降低，HDL-C濃度顯著升高，說明BA能夠改善脂肪代謝功能；肝組織中MDA含量顯著降低、GSH-Px、SOD活力顯著升高，說明BA能夠增強(qiáng)SOD及GSH-Px的活力，提高肝臟抗氧化系統(tǒng)的能力，減少細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量。

JTTA組各項(xiàng)指標(biāo)與BA處理組具有相同的變化趨勢(shì)，肝功能與脂肪代謝功能均得到顯著改善，肝臟抗氧化能力也顯著增強(qiáng)。且與等劑量BA處理組相比，大部分指標(biāo)表示其對(duì)酒精性肝損傷也具有同樣良好的干預(yù)作用。

BA和JTTA均可以通過降低酒精對(duì)肝臟抗氧化系統(tǒng)的損傷，抑制脂質(zhì)過氧化達(dá)到保肝護(hù)肝的目的。紅棗中含有白樺脂酸、熊果酸、齊墩果酸等多種具有保肝作用的三萜酸，可以有效干預(yù)酒精性肝損傷，為將紅棗開發(fā)為保肝護(hù)肝保健食品提供科學(xué)依據(jù)。

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