白頭翁與蠐螬不同配伍比例體外抗病毒作用研究

顏娓娓，徐佳馨，王繼鋒，崔真真，史晨曉，周長征

（1.山東中醫(yī)藥大學，濟南 250300；2.山東中醫(yī)藥大學藥學院，濟南 250300）

白頭翁，別名胡王使者、白頭公，始載于《神農本草經》，為毛莨科植物白頭翁的干燥根。《中藥大辭典》認為，其“味苦，性溫”[1]，具有清熱涼血、解毒等功效，用于治療結腸炎，慢性腹瀉，消化性潰瘍，血痔，滴蟲性陰道炎等[2]。目前，研究[3-6]發(fā)現，白頭翁有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗滴血蟲、殺精、保肝、抗病毒等藥理作用。蠐螬，別名土蠶、核桃蟲，始載于《神農本草經》，是金龜子科昆蟲朝鮮黑金龜子及同屬近緣昆蟲的干燥幼蟲。《中藥大辭典》認為，其“味咸，微溫”[1]，具有破血、行瘀、散結、通乳等功效，用于治療丹毒、目翳、癰疽、痔漏等[7]?，F代藥理學研究[8-9]表明，蠐螬具有治療眼疾、抗腫瘤、保肝、抗菌、抗腸道EV-71病毒等作用。呼吸道合胞病毒（RSV）是引起嬰幼兒下呼吸道感染最主要的病毒病原；是一種單負鏈RNA病毒，屬于副黏液病毒科肺炎病毒屬，包括A、B 2種亞型。據WHO估計每年約有6 400萬兒童感染RSV，其中約有16萬例死于RSV相關疾病[10-11]。腸道EV-71病毒主要通過糞-口途徑傳播，人類是目前已知的唯一宿主[12]。本實驗采用白頭翁、蠐螬抗病毒所篩選的最佳工藝進行提取、分離、配伍，并做體外抗病毒實驗，測定各配伍比例體外抗病毒的TI值。

1 材料與方法

1.1 材料 1）設備：旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器有限公司）；二氧化碳細胞恒溫培養(yǎng)箱（美國FOMAS公司）；二氧化碳病毒恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械一廠）；超凈工作臺（上海力申科學儀器有限公司）；高速臺式離心機（TD5M型，長沙湘智離心機儀器有限公司）；CKX-31倒置顯微鏡（Olympus公司）；熒光倒置顯微鏡（Olympus公司）；MK3酶標儀（Labsystems公司）；96孔細胞培養(yǎng)板（美國Corning公司）；液氮罐（四川液氮罐廠）。2）藥品：白頭翁（吉林國安藥業(yè)有限公司）；蠐螬（吉林國安藥業(yè)有限公司）。3）病毒株與宿主細胞 ：呼吸道合胞病毒、腸道EV-71病毒（引自中國疾病預防控制中心病毒病研究所流感病毒研究室）；MA104細胞（山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所微生物室提供）。4）主要試劑：1640細胞培養(yǎng)液（美國GIBCO產品，含質量分數為10%牛血清）；1640細胞維持液（美國GIBCO產品，含質量分數為2%牛血清）；PBS磷酸鹽緩沖溶液（自制）（含 Na Cl 8 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g，Na2HPO42.9 g，加三蒸水至1 L，過濾除菌，分裝置 4℃ 備用）；EDTA-0.25%胰酶（Amresco公司）；0.1%中性紅染料（上?；瘜W試劑三廠）；中性紅脫色液。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液制備

1.2.1.1 白頭翁與蠐螬提取物的制備 稱取白頭翁50 g，分別加入10、8倍水回流提取2次，時間分別為2、1.5 h，趁熱抽濾、合并濾液，將濾液減壓濃縮至50 mL，裝入EP管中貼標簽備用；稱取蠐螬50 g，分別加入12、10倍水煎煮提取2次，時間分別為2 h，趁熱抽濾、合并濾液，將濾液減壓濃縮至50 mL，裝入EP管中貼標簽備用。

1.2.1.2 水提醇沉 量取白頭翁提取液30 mL，向其緩慢加入體積分數為95%的乙醇并快速攪拌，調節(jié)乙醇濃度至70%；冷藏靜置24 h、抽濾、向濾餅中加入適量水超聲溶解，并濃縮至質量分數為1 g/mL，裝入EP管中貼標簽備用。量取蠐螬提取液30 mL，向其緩慢加入體積分數為95%的乙醇并快速攪拌，調節(jié)乙醇濃度為50%；冷藏靜置48 h、抽濾、向濾餅中加入適量水超聲溶解，并濃縮至質量分數為1 g/mL，裝入EP管中貼標簽備用。

1.2.1.3 大孔樹脂的預處理和上樣 稱取X-5型大孔樹脂200 g，先用95%乙醇浸泡24 h，再將浸泡溶脹好的大孔樹脂以濕法裝柱，用足量的蒸餾水沖洗至無醇味；用體積分數為5%HCI溶液浸泡3 h，用蒸餾水沖洗至流出液為pH呈中性；用體積分數為5%的NaOH溶液浸泡3 h，用蒸餾水沖洗至流出液pH呈中性，密封，備用。

稱取D101型大孔樹脂200 g，同上處理。將2.1.2中白頭翁水提醇沉的沉淀溶解液加入X-5型大孔吸附樹脂柱中，使其藥液液面高于樹脂柱上表面2 cm，靜置1 h；分別以蒸餾水，體積分數分別為25%、50%、75%的乙醇為洗脫液進行洗脫，控制流速為3BV/h，每一洗脫液沖至無色，裝入EP管中，貼標簽備用。將1.2.1.2中蠐螬水提醇沉的沉淀溶解液加入D101型大孔吸附樹脂柱中，同上處理。

1.2.1.4 白頭翁與蠐螬配伍 將白頭翁、蠐螬大孔樹脂吸附法流出液水1部位進行配伍，調節(jié)白頭翁水1部位與蠐螬水1部位分別為1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1，裝入EP管中，貼標簽備用。

1.2.2 體外抗病毒實驗

1.2.2.1 細胞的復蘇及培養(yǎng) 將液氮罐中的MA104細胞凍存管取出，投入37～40 ℃的溫水中迅速攪拌使凍存液溶化（盡量在1 min內完成溶解）；將凍存管于800 r/min的條件下離心5 min，在超凈工作臺內取出棄去凍存液；在細胞沉淀中加入適量10%的1640細胞培養(yǎng)液混勻，轉移到培養(yǎng)瓶內，補加10%的1640培養(yǎng)液至12 mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長成單層后，用質量分數為0.25%胰酶消化，將MA104細胞進行1:2傳代，待細胞長成單層時用于實驗。

1.2.2.2 病毒的擴增 1）呼吸道合胞病毒（RSV）的擴增：將病毒毒株200 μL接種于已經長成單層的MA104細胞上，吸附5 min后加入12 mL 2% 1640置37 ℃、5% CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并設細胞對照，其中細胞對照相同操作將毒株換成1640維持液。待細胞的病變率達到90%以上時，取出，反復凍融3次，吹打離心（5 000 r/min，5 min），取上清液定量分裝于西林瓶中，膠布封口，放于- 80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?）腸道EV-71病毒的擴增：將病毒毒株400 μL接種于已經長成單層的MA104細胞上，吸附15 min后加入12 mL2% 1640置37 ℃、5% CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并設細胞對照，照1.2.2.2中方法1）進行處理，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 測定方法 將各供試品用質量分數為2%的1640細胞維持液分別作2倍比系列稀釋共12個稀釋度，設3個復孔，依次每孔加入50 μL橫向接種于已長成單層的病毒宿主細胞的96孔板中，每孔再加入100倍TCID50的RSV病毒50 μL，同時設病毒對照組、細胞對照組及藥物毒性組，并設3個復孔。同法處理，每孔加入100倍TCID50的EV-71病毒50 μL，同時設病毒對照組、細胞對照組及藥物毒性組，并設3個復孔。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞病變，待病毒對照組出現90%以上的病變時，用電子顯微鏡仔細觀察，找出較為有效的部位。將96孔板中的培養(yǎng)液輕輕拍出，每孔加入100 μL中性紅染液，放入37 ℃條件下反應1 h后取出，倒出中性紅染液，小水流沖洗3～5次，每孔加入100 μL脫色液，恒溫箱放置15 min，用酶標儀在540 nm波長下測定OD值[13]。

1.2.2.4 病毒毒力的測定 按照常規(guī)病毒毒力的測定，選擇常用的病毒毒力測定時間為48 h作為測定時間測定實驗所需病毒的毒力。根據Reed-Muench公式計算病毒液的半數感染濃度（TCID50）。1）測定方法：將病毒用維持液做12倍比系列稀釋不同濃度，縱向重復3孔依次接種于已長成單層的宿主細胞的96孔板中，同時設細胞對照。37℃、5% CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下逐日觀察，連續(xù)觀察4 d，加1%中性紅50 μL置37 ℃條件下染色1 h，棄染液，用蒸餾水將多余染液充分洗滌，加脫色液100 μL，室溫脫色10 min，用酶標儀在540 nm波長條件下測定OD值。細胞存活率=實驗組OD值/細胞對照組平均OD值×100%。細胞病變率= 1-細胞存活率。細胞比距=（高于50%病變率- 50%）/（高于50%病變率-低于50%病變率）。TCID50= Antilog（高于50%細胞病變率稀釋度的值+比距）。測定結果：病毒在宿主細胞的TCID50值測定結果，見表1。

表1 各病毒的TCID50

2 結果

應用Reed-Muench方法計算藥物半數有效濃度（EC50）和治療指數（TI）。EC50= [Antilog（高于50%存活率藥物稀釋度的值-比距）]×C，TC50= [Antilog（高于50%病變率藥物稀釋度的值-比距）]×C，TI =TC50/EC50。白頭翁與蠐螬不同配伍比例對抗呼吸道合胞病毒和抗腸道EV-71病毒的作用結果，見表2、表3。表2 白頭翁、蠐螬不同配伍比例抗呼吸道合胞病毒結果

配伍比例 TC50 EC50 TI 1:9 2-2.1 - -2:8 2-2.1 - -3:7 2-2.3 2-5.4 9.190 4:6 2-2.0 2-5.0 8 5:5 2-2.3 - -6:4 2-2.0 2-6.1 17.148 7:3 2-2.1 2-6.1 16 8:2 2-2.2 2-4.15 3.864 9:1 2-2.1 2-7.1 32

表3 白頭翁、蠐螬不同配伍比例抗腸道EV-71病毒結果

結果顯示，白頭翁、蠐螬配伍后抗腸道EV-71病毒的整體效果優(yōu)于抗呼吸道合胞病毒；其中，白頭翁與蠐螬配伍比例為8:2時抗腸道EV-71病毒效果最好，TI = 68.594.

3 小結

病毒性疾病具有發(fā)病率高、對抗生素類藥物不敏感等特點，而中藥作為資源豐富的傳統(tǒng)藥材，毒副作用小，具有廣泛的研究價值[14]。

本實驗研究只是證明了白頭翁與蠐螬配伍對腸道EV-71病毒有良好的抑制作用，且篩選出最佳配伍比例為白頭翁：蠐螬= 8:2；在后續(xù)的研究中將會對白頭翁與蠐螬配伍抗病毒作用機制進行深入探究。中藥抗病毒的作用機制主要可歸納為：直接殺滅病毒或降低病毒毒力；阻止病毒的吸附及侵入；抑制病毒的DNA或mRNA的轉錄和復制；抗氧化作用；調節(jié)細胞因子的產生等[15-17]。隨著研究的深入，必能闡明抗病毒的具體作用機制并分離出有效單體。

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