不同炮制方法對連翹中連翹苷及連翹酯苷A含量的影響

韋永浩，周 安,2*，韓榮春,3*，俞年軍，郭俊鋒，曹 勇，朱月健，宋四清

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥 230012；2. 新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室，合肥 230038；3. 安徽省高校科研創(chuàng)新平臺團隊 中藥飲片產(chǎn)地加工與炮制一體化關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新團隊，合肥 230012；4. 陵川縣農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)局，山西 晉城 048300；5.安徽濟人藥業(yè)有限公司，安徽 亳州 236800；6.山西九州天潤道地藥材開發(fā)有限公司，山西 晉城 048300）

連翹藥材分青翹和老翹，為《中華人民共和國藥典》（簡稱《藥典》）所收載，味苦、微寒，有清熱解毒、疏風(fēng)散結(jié)之功[1]。其主要化學(xué)成分包括木脂素類、黃酮類、揮發(fā)油類和苯乙醇苷類?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[2-3]證明，以連翹酯苷為代表的生物活性物質(zhì)對認(rèn)知障礙有明顯的治療作用，同時在抗菌抗炎、解熱、降脂保肝、抗氧化及防耳毒性方面也有廣闊的應(yīng)用前景。連翹在我國分布廣泛[4]，目前連翹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究主要集中在不同地區(qū)連翹藥材道地性、適宜采收期以及基于HPLC和UPLC等的指紋圖譜分析方面[5-10]。連翹酯苷在連翹中的含量較高[11-12]，國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定以干燥品計，連翹苷和連翹酯苷A含量不得低于0.15%和0.25%，并且兩者的含量測定分開。本研究通過采集道地產(chǎn)區(qū)青翹，分別以蒸汽、水煮及生曬方式進行加工后，利用島津LC-16的雙波長模式，以連翹苷和連翹酯苷A為考察指標(biāo)，將不同炮制方法對藥材品質(zhì)影響進行評價，為有效監(jiān)測和提高連翹品質(zhì)提供參考。

1 材料

島津LC-16高效液相色譜儀（日本島津公司），AS20500BDT型超聲清洗器（Auto Science），DFY-300多功能高速中藥粉碎機（溫州頂歷），甲醇色譜純、乙腈色譜純（瑞典Oceanpak公司），冰醋酸色譜純（上海阿拉丁試劑），Cascada超純水系統(tǒng)（北京頗爾），實驗使用的其他試劑均為分析純。連翹苷（批號110821-201615，純度＞94%），連翹酯苷A（批號111810-201606，純度＞93%）標(biāo)準(zhǔn)品購自于中國食品藥品檢定研究院。

連翹藥材采集于山西陵川縣及河南輝縣，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院俞年軍教授鑒定為木犀科植物連翹Forsythia suspense（Thunb.）Vahl的干燥近成熟果實（青翹）。收集的連翹標(biāo)本存放于本校生藥系實驗室，地理位置及海拔數(shù)據(jù)，見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[1]ACQUITY UPLC BEH Amide C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；流動相乙腈- 0.3%冰醋酸（15:85），流速1.0 mL/min；連翹苷檢測波長277 nm，連翹酯苷A檢測波長330 nm；柱溫30 ℃。對照品HPLC圖譜。

表1 連翹樣品采集信息

2.2 對照品溶液制備 精密稱取連翹苷對照品1.83 mg，以70%甲醇為溶劑溶解于2 mL量瓶中，搖勻；同法稱取連翹酯苷A對照品4.45 mg，以70%甲醇溶解于10 mL量瓶中，搖勻。因連翹酯苷A不穩(wěn)定，對照品溶液在臨用時配制（4 ℃冰箱保存）。

2.3 連翹炮制方法

2.3.1 蒸汽殺青組 本組影響因素主要包括蒸汽溫度與蒸制時間。參考九州天潤道地藥材開發(fā)有限公司生產(chǎn)實踐中總結(jié)的經(jīng)驗，將樣品置入以常壓加熱超純水至沸騰所產(chǎn)生的蒸汽（100 ℃）中，樣品堆積厚度為5 cm，蒸制12 min后立即將樣品移出，置于竹片編成的盛器中瀝干水分后，在60 ℃烘箱中烘干備用。

2.3.2 水煮殺青組[13]加水量和煮制時間與結(jié)果有高度相關(guān)性。本實驗采用物料與水1:6方式，每份樣品500 g，待容器中加熱的超純水（600 mL）沸騰后，放入連翹，煮制8 min。取出瀝干水分，烘箱中60 ℃烘干備用。

2.3.3 生曬組 將連翹樣品置于可全天接受日光直曬的干凈水泥地面上，生曬期間氣溫29～40 ℃，地表溫度35～66 ℃。待樣品干燥后，留存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 供試品溶液制備 取連翹樣品粉末（60 ℃干燥40 min）約0.5 g過3號篩，精密稱定，置于具塞廣口瓶中，按照30:1的料液比加入70%甲醇溶液，超聲30 min，頻率40 Hz，功率250 W。超聲結(jié)束，提取液冷卻至室溫，用70%甲醇溶液補足失重。過濾，取續(xù)濾液，用移液槍精密吸取10 μL，置于2 mL EP管中，蒸汽殺青組和水煮殺青組分別用提取溶劑稀釋100倍，生曬殺青組用提取溶劑稀釋10倍，全部用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為藥材供試品備用。

2.5 線性關(guān)系考察 配制系列濃度的連翹酯苷A（臨用時配制，并于4 ℃冰箱中保存）和連翹苷對照品溶液，精密吸取20 μL對照品溶液，注入液相色譜儀，平行進樣2次，以溶液濃度對峰面積積分值進行回歸，2個成分的線性關(guān)系，見表2。

表2 連翹中2種成分的線性關(guān)系

2.6 精密度考察 分別取連翹苷及連翹酯苷A對照品溶液20 μL，連續(xù)進樣6次并記錄峰面積和保留時間；結(jié)果表明，連翹苷、連翹酯苷A的峰面積RSD值分別為0.94%和1.5%；保留時間RSD值分別為1.4%、2%。提示儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性考察 精密稱取S2號樣品6份，按2.4項下方法分別制備供試品溶液，按上述連翹苷及連翹酯苷A分析色譜條件依次進行檢測，記錄峰面積。計算得到連翹苷、連翹酯苷A含量RSD值分別為1.2%和1.4%。表明提取及檢測方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性考察 取S2號供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h進樣分析，記錄峰面積。測得連翹苷、連翹酯苷A峰面積分別為1.7%和1.9%。表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.9 加樣回收率試驗 將S2號樣品2種指標(biāo)性成分經(jīng)HPLC分析明確其含量后，加入精密稱重的連翹苷和連翹酯苷A對照品，分別按2.4項下制備以獲得待測加樣回收樣品，高效液相儀測定后計算回收率。連翹苷加樣回收率為95.2%～97.4%（平均值回收率為96.3%，RSD為1.4%）；連翹酯苷A加樣回收率為95.1%～98.8%（平均值為97.0%，RSD為1.9%）。

2.10 連翹苷及連翹酯苷A含量測定 分別取20 μL對照品及樣品溶液依次注入HPLC儀進行分析，記錄其色譜圖，蒸汽殺青、水煮殺青及生曬組連翹特征HPLC圖譜。使用外標(biāo)一點法計算不同炮制方法得到的樣品中連翹苷和連翹酯苷A含量，結(jié)果見表3。

表3 不同炮制組連翹苷及連翹酯苷A含量

2.11 統(tǒng)計學(xué)分析 采用3.3.1版本R軟件[14]進行數(shù)據(jù)分析。對3種不同炮制方法計算得出的連翹苷含量數(shù)據(jù)進行Bartlett χ2檢驗，提示3組樣本總體方差不等，連翹苷組P = 0.001＜0.05；連翹酯苷A組P = 0.001＜0.05，故采用Kruskal-Wallis方法進行秩和檢驗。結(jié)果顯示，連翹苷組P = 5.677e-5＜0.001，連翹酯苷組P =6.196e-5＜0.001，均提示不同炮制組的2種指標(biāo)成分含量均數(shù)不相等或不全相等。隨后采用Wilcoxon方法進行樣本間的兩兩比較，發(fā)現(xiàn)蒸汽與水煮方式對連翹苷含量影響無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.969 5＞0.05），而生曬組與蒸汽組（P = 0.000 2＜0.001）、水煮組（P =0.000 2＜0.001）差別均有統(tǒng)計學(xué)意義；同樣，蒸汽與水煮加工方式對連翹酯苷A含量影響無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.853 4＞0.05），生曬與蒸汽處理組（P = 1.083e-5＜0.001）、水煮組（P = 1.083e-5＜0.001）差別均有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

本實驗采集連翹道地產(chǎn)區(qū)青翹樣品共10組，經(jīng)蒸汽、水煮及生曬方式進行加工后檢測其2種指標(biāo)性成分的含量，發(fā)現(xiàn)生曬組連翹苷含量均低于2015版《藥典》[1]標(biāo)準(zhǔn)，而其余各組結(jié)果均優(yōu)于該標(biāo)準(zhǔn)。針對樣品進樣前的稀釋倍數(shù)，分別考察了稀釋10倍，100倍，1 000倍3個不同的稀釋倍數(shù)，發(fā)現(xiàn)蒸汽殺青組和水煮殺青組稀釋10倍時，連翹酯苷A峰面積明顯超出標(biāo)曲范圍，而稀釋1 000倍時，連翹苷已無吸收峰，所以，以稀釋100倍的樣品溶液進樣，同時考察了生曬組的適宜稀釋倍數(shù)，最終確定為稀釋10倍。白吉慶等[15]通過正交實驗方法，研究得出：青翹以4倍量水煮制10 min，其連翹苷及連翹酯苷A含量高于蒸汽殺青組。本實驗重點考察蒸汽、水煮組與生曬組對品質(zhì)差異的影響，蒸汽殺青采用陵川縣連翹加工企業(yè)經(jīng)驗方法，水煮殺青采用山西大學(xué)姜濤[13]的研究方法。就連翹苷含量而言，蒸汽及水煮殺青后，2組含量經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且含量范圍為0.59%～0.79%，達到《藥典》最低限量標(biāo)準(zhǔn)4倍以上?？疾爝B翹酯苷A含量，3種處理方法均達到《藥典》標(biāo)準(zhǔn)，但生曬組含量明顯低于蒸汽和水煮殺青組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義；蒸汽和水煮組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。該研究結(jié)果提示，作為傳統(tǒng)產(chǎn)地和加工地，山西陵川縣及周邊河南輝縣的連翹品質(zhì)可靠；蒸汽和水煮處理青翹以殺酶保苷，對于保證和控制藥材質(zhì)量較生曬方式優(yōu)勢明顯?！端幍洹芬?guī)定青翹以蒸制方式處理，但根據(jù)本研究結(jié)果，在條件不具備的地區(qū)，可以考慮以水煮方式進行產(chǎn)地加工；當(dāng)然，水煮對于連翹中其他藥效成分有無不利影響，有待進一步研究。生曬過程中，由于干燥溫度相對較低，有效成分可能在酶的作用下發(fā)生降解，從而使其有效成分含量大幅降低；而蒸汽和水煮處理時的高溫可使酶在短時間內(nèi)滅活而起到良好的保苷作用。水煮往往使部分有效物質(zhì)溶出而降低其含量，青翹外果皮包被的角質(zhì)層可能在較短時間內(nèi)（水煮時間為8 min）對于物質(zhì)溶出起有效的阻礙作用，使得本加工方式與蒸汽組的有效成分含量無明顯差異。明確蒸汽和水煮方式在保證連翹苷和連翹酯苷A含量方面優(yōu)于傳統(tǒng)生曬方法，對于控制連翹藥材質(zhì)量和指導(dǎo)產(chǎn)地加工具有一定的借鑒意義。

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