人參蛋白的提取和體外免疫調(diào)節(jié)活性研究

王鈺瑩，閆福源，閆凱麗，王任晶，許 寧，王丹陽(yáng)，汪 瑩，何慧楠，劉 莉

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117）

人參為五加科植物人參（Panax ginseng C. A.Meyer.）的干燥根及根莖。人參被人們視為百草之王，具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、生津止渴等功效[1]。人參具有多種化學(xué)成分，主要包括皂苷類、揮發(fā)油類、氨基酸類、脂肪酸類、糖類、蛋白質(zhì)及多肽、無機(jī)鹽類等[2-6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[7-9]表明，人參具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、降血糖等活性，并對(duì)其他藥理活性起著協(xié)同調(diào)節(jié)作用。人參皂苷被認(rèn)為是人參的主要活性成分，近年來的研究[10-13]表明，人參多糖，人參蛋白等大分子也具有明顯的生物活性。本研究針對(duì)人參當(dāng)中的大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)進(jìn)行提取和性質(zhì)檢測(cè)，并以小鼠巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)人參蛋白體外的免疫調(diào)劑活性進(jìn)行初步的探索研究，為把人參蛋白開發(fā)成保健食品的原料提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)于Gibco公司；MTT（噻唑藍(lán)），購(gòu)于Thiazoly公司；DMSO，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；PGE2酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒、TNF-α酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒，購(gòu)自上海朗頓生物科技有限公司；脂多糖（LPS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（SDS） 均購(gòu)于 Sigma 公司；Infinite 200 Pro型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，購(gòu)自瑞士TECAN公司，3111型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo Forma公司。

1.2 細(xì)胞株 小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞株 RAW 264.7（ATCCTIB-71），購(gòu)自武漢普諾賽生物技術(shù)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人參蛋白的提取 稱洗凈鮮人參500 g，加入濃度為0.01 mol/L，pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液5 000 mL，勻漿，4 ℃ 浸提，每隔1 h用0.01 mol/L的Tris溶液調(diào)節(jié)pH至中性，浸提12 h后，用絹布過濾浸提液，濾渣加入5 000 mL Tris-HCl緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.4）4 ℃浸提12 h，用兩層絹布過濾浸提液，合并浸提液，4 000 r/min離心20 min，收集上清。用中空纖維膜過濾系統(tǒng)超濾（0.45 μm）和微濾（MW 10 000）浸提液，收集大分子濾液，向?yàn)V液中緩慢加入(NH4)2SO4，使飽和度達(dá)到75%，4 ℃沉淀12 h后，4 000 r/min離心20 min，收集沉淀，用少量蒸餾水溶解，透析（MW 8 000），凍干，即得人參總蛋白（GP）。

1.3.2 人參蛋白的含量測(cè)定 采用lowry法測(cè)定蛋白含量，按照試劑盒使用說明書測(cè)定人參蛋白的含量。

1.3.3 人參蛋白分子量分布測(cè)定 采用SDS-PAGE電泳測(cè)定人參蛋白的亞基分子量分布。

1.3.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 在RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)3代生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后，將RAW 264.7細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞懸液中細(xì)胞個(gè)數(shù)，使其細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，鋪于96孔板，每孔100 μL。適宜條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度藥物每孔20 μL，分別是 50、100、200 μg/mL，補(bǔ)加培養(yǎng)基至100 μL，平行設(shè)6組，空白組以同體積無菌PBS代替，陽(yáng)性對(duì)照組加入同體積20 μg/mL LPS，培養(yǎng)24 h。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：加入濃度為5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，將培養(yǎng)基吸出，加入180 μL DMSO，振搖10 min，在波長(zhǎng)490 nm處，測(cè)定OD值。

1.3.5 NO含量檢測(cè) 將細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞液接種于96孔板，每孔100 μL，置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。參照NO含量測(cè)定試劑盒說明，振搖10 min，在波長(zhǎng)490 nm處，測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔繪制出亞硝酸濃度與光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品孔NO濃度。

1.3.6 PGE2、TNF-α含量檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)液中PGE2的測(cè)定參照酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒說明，細(xì)胞懸液在10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，吸取上清20 μL進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)，在450 nm測(cè)定吸光度值（OD值），計(jì)算PGE2含量。 細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α的測(cè)定參照酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒說明，細(xì)胞懸液在10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，吸取上清20 μL進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)，在450 nm測(cè)定吸光度值（OD值），計(jì)算TNF-α含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。t 檢驗(yàn)采用SPSS 19.0軟件完成，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參蛋白的蛋白含量和分子量分布 采用lowry法測(cè)定人參蛋白的蛋白含量為1.95 mg/mL，人參蛋白的亞基分子量從8 kD 到 66 kD，其中分子量為28 kDa的和26 kDa的蛋白含量最高。

2.2 人參蛋白對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響 見圖1。細(xì)胞吞噬能力與樣品濃度呈量效關(guān)系。結(jié)果表明，人參蛋白具有增強(qiáng)細(xì)胞吞噬能力的作用（P＜0.01）。

圖1 人參蛋白對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活性的影響

2.3 人參蛋白對(duì)RAW 264.7細(xì)胞釋放NO的影響 測(cè)定NO含量所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y = 0.013 2 X+0.106 9，R2=0.999 3。結(jié)果空白組產(chǎn)生NO最少，陽(yáng)性對(duì)照組分泌的NO含量最高，給藥濃度增加，細(xì)胞分泌的NO含量也增加。實(shí)驗(yàn)組與空白組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且各實(shí)驗(yàn)組NO濃度均低于陽(yáng)性對(duì)照組。

2.4 人參蛋白對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌PGE2、TNF-α的影響 見圖2。

如圖2所示，與空白組相比，給藥組細(xì)胞分泌的PGE2較多。人參蛋白可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌PGE2，使其上清中PGE2含量增加，和空白組對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 人參蛋白對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌PGE2、TNF-α的影響

實(shí)驗(yàn)所配置的藥物濃度均能使細(xì)胞分泌TNF-α的含量增加，與空白組比較，P＜0.01，藥物濃度最大時(shí)，細(xì)胞分泌TNF-α含量最高。各組TNF-α分泌量相比，陽(yáng)性對(duì)照組含量最高，說明人參蛋白促進(jìn)細(xì)胞分泌TNF-α的同時(shí)，對(duì)細(xì)胞作用溫和。

3 討論

近年來，有文獻(xiàn)[14]表明，人參可以提高淋巴細(xì)胞的增殖能力，說明人參具有免疫增強(qiáng)的作用。本實(shí)驗(yàn)研究從人參中提取的人參蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞經(jīng)過人參蛋白作用后，釋放NO含量，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和前列腺素E2（PGE2）的含量增加，并且對(duì)細(xì)胞無毒性。當(dāng)人參蛋白濃度較大的時(shí)候，作用較為顯著且溫和。人參蛋白可以提高巨噬細(xì)胞的免疫功能，其中的作用機(jī)制可以進(jìn)一步研究。本研究表明不同濃度的人參蛋白作用于RAW 264.7細(xì)胞，細(xì)胞NO分泌增多，說明人參蛋白可通過上調(diào)限制酶iNOS的表達(dá)來促進(jìn)NO分泌，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞殺死病原微生物的能力[15-16]。

巨噬細(xì)胞還有免疫遞呈的作用。巨噬細(xì)胞免疫遞呈作用是通過釋放PGE2、TNF-α等免疫因子來實(shí)現(xiàn)的，這些免疫因子刺激T/B細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本研究表明，不同濃度的人參蛋白可促進(jìn)細(xì)胞釋放PGE2、TNF-α。

由上述結(jié)果可知，人參中的人參蛋白能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的免疫活性，可以從釋放免疫因子等方面增強(qiáng)免疫活性。人參可以作為增強(qiáng)免疫力保健品的原材料。

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