淫羊藿苷對BALB/c-nu裸小鼠雄激素依賴性前列腺癌雄激素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

陳少秀，饒 紅，陳德森

（1.十堰市太和醫(yī)院，湖 北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 湖北 十堰 442000）

淫羊藿別名短角淫羊藿，性溫、味辛甘，走肝腎二經(jīng)，為強筋骨、益精氣、補腎壯陽、補命門及祛風(fēng)除濕之要藥[1-2]。其主要成分為淫羊藿苷，目前研究[3-4]認為，淫羊藿苷抗腫瘤機制多與其影響腫瘤細胞相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及相關(guān)因子表達有關(guān)。前列腺癌為前列腺腺泡細胞基因突變引發(fā)的前列腺惡性腫瘤，多發(fā)于中老年男性，對其積極防治可降低發(fā)病率、提高生存率。在前列腺腺泡細胞基因突變及癌變過程中，P13K/Akt通路及相關(guān)因子與前列腺腺泡癌變細胞凋亡及增殖等方面發(fā)揮重要作用[5]。目前，對單體淫羊藿苷的研究[6]已證實，其對前列腺腺泡癌變細胞具有抑制細胞周期、降低細胞侵襲力及轉(zhuǎn)移等作用。但其抑癌抗癌是否是通過影響P13K/ Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及相關(guān)因子表達的活體動物實驗卻缺乏相關(guān)報道，本實驗系統(tǒng)觀察了淫羊藿苷對BALB/c-nu裸小鼠P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及相關(guān)因子表達的影響，為其可能用于臨床治療雄激素依賴性前列腺癌提供實驗及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 SPF級BALB/c-nu裸小鼠，雄性，40只，體質(zhì)量（20.50±1.50）g，采用隨機數(shù)字表編號后隨機均分為對照組、模型組、抑制劑組和實驗組（n =10只）。動物由湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心提供，SYXK（鄂）2017-0031。

1.2 藥品及試劑 淫羊藿苷，成都瑞芬思生物科技有限公司；人 LNCaP前列腺癌細胞株，基爾頓生物科技（上海）有限公司；p-Akt、p-AR、AR-V7、E-cadherin及Calcitonin等檢測用Elisa試劑盒，均購自北京綠源伯德生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LNCaP裸小鼠模型建立 將模型組、抑制劑組和實驗組共30只BALB/c-nu裸小鼠用乙醚吸入麻醉后仰臥位固定于無菌臺，手術(shù)在無菌屏蔽室進行，消毒下腹部皮膚，延腹白線切開皮和腹直肌并分離腹膜，用玻璃分針將膀胱推向尾端，使之翻轉(zhuǎn)，暴露裸小鼠生殖腺并用醫(yī)用脫脂棉簽推向左右腹壁以充分暴露裸小鼠左右葉前列腺腺體。然后抽取調(diào)制好的人LNCaP前列腺癌細胞株（約2×107個/mL）50 μL，于左右兩葉前列腺內(nèi)精確注射25 μL，還納生殖腺并逐層縫合，消毒，2周后即可建立LNCaP裸小鼠模型[7]。對照組注射等體積生理鹽水對照。

1.3.2 治療方法 在注射人LNCaP前列腺癌細胞株28 d 時，4組均采用尾靜脈注射給予相關(guān)藥物治療28 d（1次/d）。實驗組尾靜脈注射給予100 μL淫羊藿苷80 mg/kg，抑制劑組給予100 μL P13K/ Akt抑制劑LY294002，對照組、模型組給予等體積生理鹽水（100 μL）尾靜脈注射對照。

1.3.3 檢測指標(biāo)及方法 采用Western blotting法檢測前列腺癌變組織雄激素受體剪接變異體7（AR-V7）、磷酸化蛋白激酶（p-Akt）和磷酸化雄激素受體（p-AR）蛋白表達； FITC-CY3法檢測鈣黏蛋白E（E-cadherin）和降鈣素（Calcitonin）陽性率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，計量資料數(shù)據(jù)先進行正態(tài)分布及方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的組間差異采用配對資料 t檢驗，方差不齊時采用校正t檢驗，率的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組治療28 d后p-AR和p-Akt檢測結(jié)果比較 見表1。

表1 4組治療28 d后p-AR和p-Akt檢測結(jié)果比較（ ，n = 10）

表1 4組治療28 d后p-AR和p-Akt檢測結(jié)果比較（ ，n = 10）

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組 別 p-AR p-Akt對照組 0.69±0.04 0.92±0.11模型組 3.16±0.17# 1.87±0.14#抑制劑組 0.65±0.06△ 0.90±0.09 △實驗組 0.67±0.08△ 0.89±0.07 △

2.2 4組治療28 d后Calctionin、E-cadheri和AR-V7檢測結(jié)果比較 見表2。

表2 4組治療28 d后Calctionin、E-cadheri和AR-V7檢測結(jié)果比較（ ，n = 10） %

表2 4組治療28 d后Calctionin、E-cadheri和AR-V7檢測結(jié)果比較（ ，n = 10） %

注：與對照組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05

組 別 Calctionin E-cadherin AR-V7對照組 30.87±4.13 82.59±7.35 19.38±2.54模型組 46.15±5.24 # 23.46±1.73# 33.46±4.02 #抑制劑組 29.94±3.04△ 81.25±7.51△ 17.72±2.19△實驗組 31.03±2.85△ 80.34±6.97△ 19.26±1.94△

3 討論

P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑作為介導(dǎo)細胞生長、存活、抑制細胞凋亡及促進細胞增殖的經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，與前列腺腺泡細胞基因突變引發(fā)的前列腺惡性腫瘤密切相關(guān)[8]。AR為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，為雄激素受體，當(dāng)AR與雄激素結(jié)合后可激活下游靶基因，正常生理狀態(tài)下對維持前列腺祖細胞正常分化起調(diào)節(jié)作用[9]。Akt即蛋白激酶B，是P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的蛋白激酶，在細胞存活和凋亡中起重要作用[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，AR和Akt表達增強可激活P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。而激活后的P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路會促進兩者發(fā)生磷酸化反應(yīng)，生成p-Akt和p-AR，從而抑制細胞凋亡，且p-AR可促進AR向胞核轉(zhuǎn)移，加速腫瘤細胞的分化和轉(zhuǎn)移[12]。在P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的因子中，AR-V7作為AR的剪接變異體不依賴雄激素即可持續(xù)激活A(yù)R進入胞核并激活P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮促前列腺腺泡細胞基因突變及癌變的生物學(xué)效應(yīng)[13]。E-cadherin和Calctionin在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用，前者屬鈣黏附蛋白，具有增強腫瘤細胞與間質(zhì)細胞黏附力的作用，與腫瘤細胞浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)，E-cadherin高表達不利于腫瘤細胞浸潤和轉(zhuǎn)移[14]。后者由前列腺組織中的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞分泌，其高表達會促進前列腺癌產(chǎn)生去勢抵抗[15]。

本實驗抑制劑組中使用的LY294002為P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑，能有效抑制LNCaP生長，降低其侵襲、轉(zhuǎn)移能力[16]。實驗觀察到其對P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有明顯的抑制作用，而采用淫羊藿苷治療的實驗組的作用與抑制劑組作用基本相同，也可降低p-Akt及p-AR蛋白表達，降低Calctionin及AR-V7的陽性率，提高E-cadherin的陽性率，這一結(jié)果提示淫羊藿苷對P13K/ Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑中的作用靶點與LY294002相同。研究[17]表明，E-cadherin增高可增加腫瘤細胞與基質(zhì)之間的黏附力，阻止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，Calctionin降低可減少去勢抵抗，兩者共同作用可降低腫瘤細胞的侵襲能力。本實驗提示，淫羊藿苷除對P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用外，還可通過影響E-cadherin和Calctionin這一途徑影響LNCaP侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，淫羊藿苷對P13K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用可能主要是阻止Akt、AR的磷酸化過程，同是還能通過提高E-cadherin以增加腫瘤細胞與基質(zhì)之間的黏附力，降低Calctionin以減少去勢抵抗現(xiàn)象，從而實現(xiàn)抑制LNCaP細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，為研發(fā)淫羊藿苷可能用于治療原發(fā)性前列腺癌提供了實驗及理論依據(jù)。

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