新扶正除疫顆?？箍滤_奇病毒B3作用評(píng)價(jià)

朱同剛，宮曉燕

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長(zhǎng)春 130021）

新扶正除疫顆粒劑的配方為全國(guó)名中醫(yī)、國(guó)醫(yī)大師、白求恩醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?wù)芦@得者任繼學(xué)教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，用于預(yù)防和治療流感60余年，是我院應(yīng)用多年的名方，在SARS、甲型H1N1流行期間，起到了非常重要的預(yù)防和治療作用。柯薩奇病毒是一種常見(jiàn)病毒，可引起多種疾病，其中以病毒性心肌炎最為嚴(yán)重。本研究通過(guò)觀察新扶正除疫顆粒對(duì)柯薩奇病毒B3染毒小鼠心、肺組織中的病毒滴度及組織切片的變化，來(lái)觀察本藥的抗柯薩奇病毒B3的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及病毒 新扶正除疫顆粒由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研究開(kāi)發(fā)中心藥物藥劑實(shí)驗(yàn)室提供。用蒸餾水溶解顆粒，藥物濃度為0.06 g/mL?？滤_奇病毒B3毒株由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供。利巴韋林顆粒由四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，購(gòu)于藥店。

1.2 動(dòng)物及分組 3～4 周齡雄性Balb/c小鼠60只，體質(zhì)量（10±2）g，由吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；隨機(jī)分為空白對(duì)照組、病毒模型組（A組）、新扶正除疫顆粒低、中、高劑量組（B、C、D組）、陽(yáng)性藥物對(duì)照組（E組），每組10只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 給除空白對(duì)照組以外的每只小鼠腹腔注射50 μL柯薩奇病毒液（10×TCID50），常規(guī)飼養(yǎng)，存活72 h以上，且體質(zhì)量顯著降低，證實(shí)病毒感染模型成功建立。模型建立成功后，空白對(duì)照組和病毒模型組用生理鹽水0.1 mL灌胃，每24 h灌胃1次，共計(jì)7 d；新扶正除疫顆粒低、中、高劑量各組以新扶正除疫顆粒水溶液灌胃，高、中、低劑量組給藥量分別為4.5、9、18 g/（kg·d）；利巴韋林對(duì)照組以利巴韋林水溶液0.025 g/（kg·d）灌胃。1次/d，連續(xù)灌胃7 d。每天觀察小鼠的發(fā)病體征及死亡情況，稱取體質(zhì)量并記錄，同時(shí)計(jì)算生存率；各組小鼠于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死。1.4 組織中感染性病毒的分離測(cè)定 無(wú)菌操作取小鼠心、肺臟器各100 mg，用MEM細(xì)胞維持液1 mL充分勻漿。勻漿液用微孔濾膜過(guò)濾除菌后，反復(fù)凍融3次，3 000 r /min，離心30 min，取上清液，- 20 ℃保存?zhèn)溆?。取?.2 mL接種于已生長(zhǎng)成單層Hep-2細(xì)胞的96孔板中，37，5% CO2孵育2 h后棄去孔內(nèi)液體，PBS洗滌3次后，加入MEM細(xì)胞維持液，37，5%CO2培養(yǎng)72～120 h。同時(shí)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及相應(yīng)程度，對(duì)出現(xiàn)者進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定。

1.5 病理學(xué)檢查 無(wú)菌操作取小鼠心、肺臟器，立即放入10%甲醛溶液中固定。石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色后于顯微鏡下觀察各組小鼠臟器組織的病理改變。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 組間和組內(nèi)的差異采用方差分析進(jìn)行比較，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，數(shù)據(jù)檢驗(yàn)及相關(guān)分析用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 6組小鼠死亡情況比較 見(jiàn)表1。

表1 6組小鼠死亡情況比較（n = 10）

2.2 A、B、C、D、E組小鼠心、肺病毒滴度 見(jiàn)表2。

表2 A、B、C、D、E組小鼠心、肺病毒滴度（ ，n = 10）

表2 A、B、C、D、E組小鼠心、肺病毒滴度（ ，n = 10）

注：與A組比較，## P＜0.01

臟器 A組 B組 C組 D組 E組心臟 4.767±0.145 30 4.033±0.088 19 3.033±0.088 19 2.100±0.057 74 ## 1.700±0.057 74##肺臟 4.400±0.057 73 3.667±0.088 19 2.933±0.088 19 1.800 ±0.057 74## 1.067 ±0.088 19##

2.3 小鼠臟器組織病理觀察 病毒模型對(duì)照組小鼠心肌間質(zhì)血管擴(kuò)張充血，明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分心肌細(xì)胞輕度水腫；低劑量組炎細(xì)胞浸潤(rùn)范圍大，少量心肌細(xì)胞壞死，其他未見(jiàn)明顯異常；中、高劑量組心肌纖維短柱狀排列整齊，心肌間僅見(jiàn)少量炎細(xì)胞，基本正常心肌結(jié)構(gòu)；利巴韋林給藥組：基本正常心肌結(jié)構(gòu)。病毒模型對(duì)照組小鼠肺組織切片顯示：肺組織結(jié)構(gòu)不清，破壞嚴(yán)重，細(xì)支氣管壁血管擴(kuò)張充血，明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)大量炎細(xì)胞，肺泡壁血管擴(kuò)張充血，肺泡腔大量滲出物，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，提示肺臟為炎癥性病變；低劑量組肺組織結(jié)構(gòu)不清，呼吸性細(xì)支氣管以下肺組織血管擴(kuò)張充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，有出血，提示肺臟為炎癥性病變；中劑量組肺泡間隙輕度增寬，有充血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，與模型組比較肺組織結(jié)構(gòu)尚清楚；高劑量組肺泡壁血管擴(kuò)張，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，基本正常肺結(jié)構(gòu)，其結(jié)果與利巴韋林給藥組相似。

3 討論

柯薩奇病毒屬小RNA病毒科腸道病毒屬，分 A、B 2組，A組（A1～22、 24）， B組（B1～6）[1]。其中，柯薩奇病毒可引起上呼吸道感染、病毒性心肌炎等疾病。引起病毒性心肌炎的感染和非感染原非常多，最常見(jiàn)的感染原是柯薩奇病毒B組[2]。因?yàn)槠渚哂懈叨鹊挠H心肌性，尤以2、3、4型更為常見(jiàn)[3]。病毒性心肌炎在兒童及青壯年中發(fā)病率較高，多數(shù)臨床表現(xiàn)較輕，但也可致急性猝死，最終導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病和心力衰竭[4]。隨著科技進(jìn)步，對(duì)病毒性心肌炎的發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)越來(lái)越深刻，但在治療方面進(jìn)展不明顯，與過(guò)去一致，仍以抗病毒、營(yíng)養(yǎng)心肌、免疫調(diào)節(jié)等綜合治療為主[5]，尚無(wú)特效的治療方法。

新扶正除疫顆粒配方是由任繼學(xué)教授集60年臨床經(jīng)驗(yàn)提煉出的預(yù)防和治療時(shí)疫溫病的臨床效驗(yàn)方（扶正除疫湯）開(kāi)發(fā)研制而成。該方由紅景天、貫眾、大青葉、虎杖4味藥物組成。全方扶正與達(dá)邪并舉，清熱與滋補(bǔ)兼施，配伍精當(dāng)，療效確切。藥理學(xué)研究[6-14]證實(shí)，高山紅景天多糖對(duì)柯薩奇B3、B5病毒增殖有顯著的抑制作用；紅景天多糖對(duì)CVB3病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，且能抑制 CVB3病毒的繁殖；紅景天甲醇冷浸提取物對(duì)手足口病病毒71型、柯薩奇病毒B型（CVB5）、單純皰疹病毒Ⅰ型和呼吸道合胞病毒有明顯的抑制作用。大青葉在柯薩奇病毒（CVB3）心肌炎早期可能通過(guò)抑制病毒合成、增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬等作用，達(dá)到治療效果，而有效單體則是通過(guò)抑制病毒在Hep-2細(xì)胞內(nèi)的生物合成而達(dá)到抗病毒作用，并無(wú)直接滅活效果?；⒄忍崛∥飳?duì)A9及B5型柯薩奇病毒等多種病毒有抑制作用。綿馬貫眾對(duì)柯薩奇病毒 A16、B1、B3、B4 均具有較強(qiáng)的抑制作用，表現(xiàn)在對(duì)病毒的抑制和直接滅活病毒。實(shí)驗(yàn)研究[15-18]證實(shí)，扶正除疫顆粒對(duì)柯薩奇、腺病毒等多種病毒所致的細(xì)胞病變有一定的減輕作用，扶正除疫顆粒具有抗H1N1流感病毒及抗菌和抗炎作用。

本實(shí)驗(yàn)初步證明了新扶正除疫顆粒對(duì)柯薩奇病毒B3感染小鼠死亡率、心肺組織的保護(hù)作用，為柯薩奇病毒B3的治療提供了一種新方案，同時(shí)也有可能拓寬新扶正除疫顆粒的臨床應(yīng)用范圍。

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