艾灸對(duì)FCA誘導(dǎo)的AA模型大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)及血清代謝組學(xué)的影響

朱 艷，俞紅五，潘喻珍，楊 佳，吳炳坤，胡 雪，曹云燕

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年病科，合肥 230061）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種可以影響全身的自身免疫性疾病，病變不僅引起關(guān)節(jié)炎癥，還可引起肺、心等重要臟器的損傷，其中RA造成的心血管系統(tǒng)損傷為正常人群的3～4倍，甚至有人提出RA和糖尿病一樣可作為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1-3]。艾灸作為祖國醫(yī)學(xué)中最為常用的外治方法，可以溫經(jīng)通絡(luò)、活血化瘀，以改善全身及局部的血液循環(huán)，促進(jìn)機(jī)體的新陳代謝，從而扶正祛邪，有效的治療疾病[4]。本研究通過代謝組學(xué)方法尋找艾灸調(diào)節(jié)RA的標(biāo)志性代謝產(chǎn)物及其代謝通路，以明確相關(guān)物質(zhì)的變化趨勢(shì)，初步探索艾灸干預(yù)RA作用機(jī)制，為RA治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar雄性大鼠80只，體質(zhì)量（180±30）g，鼠齡5～6月，由南京生物醫(yī)藥研究院提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXF（蘇）2015-0001。實(shí)驗(yàn)室保持恒定的溫度和濕度，大鼠在明暗時(shí)間為12/12 h（明期7:00～19:00）條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器、試劑及藥品 FCA購自美國SIGMA公司；TPT：10 mg/片，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司；特制香煙型純艾條（直徑1 cm，南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠）。儀器：美國安捷倫公司GC/MS，型號(hào)為7890A/5975C。

1.3 造模方法 采用風(fēng)、寒、濕環(huán)境因素+生物因子復(fù)合造模方法[4]復(fù)制AA模型。所有除了NC組以外的大鼠均放入造模環(huán)境中20 d。于第21天在大鼠右后足跖部注射FCA 0.5 mL/只，致炎，以建立AA模型。然后觀察3 d，其中以24 h后見足踝部急性炎性腫脹，以48 h見對(duì)側(cè)肢體或前肢，甚至尾部、耳朵炎性結(jié)節(jié)或紅腫出現(xiàn)示造模成功。

1.4 分組及治療 將大鼠分為NC組20只，造模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為MC 20只、TPT組20只和艾灸組20只。艾灸組：參照文獻(xiàn)[5]選取腎俞、足三里穴，按照大鼠穴位圖譜定位穴區(qū)，剪去各穴位置區(qū)域的被毛，標(biāo)記為紅色。造模成功3 d后，予艾條在距穴位2 cm處懸灸；治療時(shí)，1次/d，選1穴，2穴交替使用，20 min/次，連續(xù)治療15 d。TPT組：以TPT溶液灌胃，按照8 mg/（kg·d）劑量，1次/d，共15 d[6]。NC組和MC組：予以生理鹽水灌胃。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法 1）關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)量[5]：分別在造模前1 d、造模后3 d、最后1次治療24 h量取各組每只大鼠的右側(cè)后足跖的容積，以算取每個(gè)大鼠的足跖腫脹度。2）AI測(cè)定[7]：分別在造模前 1 d、造模后3 d、最后1次治療24 h評(píng)估全身各個(gè)關(guān)節(jié)病變的程度。根據(jù)5級(jí)評(píng)分法進(jìn)行評(píng)價(jià)，依據(jù)右后肢體外的其余3個(gè)肢體的病變程度來累積積分，從而計(jì)算出AI。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為0分：無紅腫；1分：小趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。把每個(gè)關(guān)節(jié)積分相加即得每只大鼠的AI。3）電鏡觀察 ：在最后1次治療24 h后每組取7只大鼠，用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉大鼠后開胸取出心臟，留取左心室游離壁中層的心肌組織，切成1 mm3的小塊（在冰上操作），立即放于裝有戊二醛的緩沖液中，于4 ℃，固定2 h以上，用磷酸緩沖液浸洗約30 min，然后用四氧化鋨固定液在4 ℃固定2 h，再以磷酸緩沖液浸泡沖洗，然后選乙醇梯度進(jìn)行脫水，再以環(huán)氧樹脂Epon 812 浸透、然后包埋，美蘭染色后在光學(xué)顯微鏡下定位，以超薄切片機(jī)切成超薄片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，最后在透射電鏡下觀察、拍照。4）代謝組學(xué)檢測(cè)：血清代謝組學(xué)檢測(cè)，最后1次治療24 h后，每組取5只大鼠，取每只大鼠全血2 mL放在普通生化管內(nèi)，然后離心以3 000 r/min 速度持續(xù)10 min，吸取上層血清，儲(chǔ)存于- 80 ℃冰箱內(nèi)以進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)。在配置血清樣品時(shí)，取兩倍體積的填酸鹽緩沖液和一份血清混合，以抵消pH對(duì)化學(xué)位移的影響，然后加入適量Dss用作化學(xué)位移零點(diǎn)的定標(biāo)。在配好后滴進(jìn)5 mm樣品管并于Vari-an Unity plus 500 MHz譜儀上進(jìn)行釆集樣品的一維'H-NMR譜圖。該實(shí)驗(yàn)選用5 mmHCN三共振探頭，300 K的溫度，5 kHz的譜寬，信號(hào)共累加256次，釆樣點(diǎn)數(shù)為16 k，釆樣NOEPR-CPMG脈沖序列，其中抑制水峰信號(hào)選用預(yù)飽和脈沖序列，抑制由蛋白和脂蛋白等產(chǎn)生的寬峰，采用CPMG自旋回波序列從而得到窄的譜線。譜圖預(yù)處理，用自編軟件和MestRe-C 2. 3軟件對(duì)譜圖實(shí)行譜峰對(duì)齊、基線校正以及手動(dòng)調(diào)相。對(duì)在50.2～4.6區(qū)域范圍內(nèi)的則行自適應(yīng)積分，選用Pareto標(biāo)度化對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后；然后對(duì)積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化以構(gòu)成數(shù)據(jù)矩陣，進(jìn)行PCA和PLS-DA方法被選用對(duì)數(shù)據(jù)矩陣行統(tǒng)計(jì)分析。采用載荷圖和得分圖以分析結(jié)果并表示分析所得結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 尋找差異性代謝物最常用的方法之一是PLS-DA分析[8]。依據(jù)其變量重要性投影（VIP）＞1為閾值提示是有差異的代謝物。采用SPSS 17. 0統(tǒng)計(jì)軟件，考察代謝物含量差異的顯著性采用單因素方差分析，組間單維P檢驗(yàn)多維統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用t檢驗(yàn)，其中P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若同時(shí)滿足單維統(tǒng)計(jì)P＜0.05和VIP＞1的代謝物才是最終差異代謝物[9]。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠關(guān)節(jié)足跖腫脹度和AI的比較 見表1。

表1 4組大鼠足跖腫脹度和AI的比較（，n = 20）

表1 4組大鼠足跖腫脹度和AI的比較（，n = 20）

注：與NC組比較，## P＜0.01；與MC組比較，△△P＜0.01；與艾灸組比較，▲P＜0.05

指 標(biāo) NC組 MC組 TPT組 艾灸組致炎前1 d足跖腫脹度/% 1.81±0.19 1.80±0.17 1.79±0.12 1.82±0.11致炎后3 d足跖腫脹度/% 1.89±0.13 3.03±0.12## 2.91±0.17## 2.94±0.16##致炎后18 d足跖腫脹度/% 1.91±0.23 2.62±0.07## 2.42±0.09△△ 2.32±0.10△△致炎后 3 d AI 值 /分 0 9.31±0.76## 9.36±1.05## 9.20±01.07##致炎后18 d AI 值/分 0 6.79±1.19## 4.61±0.91△△▲ 3.57±0.89△△

2.2 病理學(xué)結(jié)果 NC組大鼠線粒體膜邊界清晰，嵴縱行排列密集有規(guī)律，橫紋排列清晰有序；MC組大鼠的線粒體膜邊界不清，腫脹明顯，嵴稀疏，橫紋大部分消失，體內(nèi)大部分呈空泡狀態(tài)；TPT組大鼠線粒體輕度腫脹，有輕度空泡化，嵴和橫紋排列輕度紊亂但尚清楚；艾灸組大鼠線粒體呈橢圓形或長(zhǎng)方形排列于肌纖維間，略腫脹，膜尚清晰，嵴和橫紋分布基本整齊有序。

2.3 血清樣本的總離子流色譜圖（TIC） 見圖1。肉眼可見的每個(gè) TIC 圖上的色譜峰下可能包含若干個(gè)共流出峰，數(shù)據(jù)復(fù)雜。大量的色譜峰均被GC/MS從每個(gè)樣本中檢測(cè)到。采用軟件算法對(duì)采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理分析，將復(fù)雜的質(zhì)譜信號(hào)轉(zhuǎn)化成有用定性定量數(shù)據(jù)。同時(shí)，在以下分析中選用多維統(tǒng)計(jì)和單維統(tǒng)計(jì)相結(jié)合的方法來獲取組學(xué)特征，以表征群體之間的代謝特征。

2.4 PCA 輪廓分析 PCA 模型常用于真實(shí)地反映各組間的差異，但是由于代謝組較基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組過于靈敏，因此受到遺傳背景和環(huán)境干擾的影響比基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組要大，如果組間差異較小，這個(gè)模型對(duì)于哺乳動(dòng)物來說，通常無效。為了消除這種影響，通常采用監(jiān)督性模型，如PLS-DA。用模型質(zhì)量參數(shù)R2X（X 模型的解釋率）、R2Y（Y觀察量即組間差異的解釋率）、Q2（預(yù)測(cè)率）來表示模型質(zhì)量。一般來說，它們的值大于 0.5，即表示模型質(zhì)量較好[10]，血清組PCA-X4個(gè)主成分R2X =0.52；因此，用2種PCA法建立的模型具有較高穩(wěn)定性。

2.5 PLS-DA 從各組血清PLS-DA得分圖可知，以模型的可解釋指標(biāo)R2X和可預(yù)測(cè)指標(biāo)Q2，血清PLS-DA 2個(gè)主成分 R2X = 0.24，R2Y = 0.594，Q2 = 0.161。結(jié)果提示，所建立的數(shù)學(xué)模型比較可靠，說明組間代謝組的差異比較顯著。

圖1 血清樣本的總離子流色譜圖（TIC）

2.6 血清中潛在的生物標(biāo)志物信息 見表2。MC組較NC組的變化主要體現(xiàn)于葡萄糖、丙氨酸、鳥氨酸、蔗糖低下，對(duì)甲酚、花生四烯酸增強(qiáng)；艾灸組的變化較MC組的變化主要體現(xiàn)于葡萄糖增強(qiáng)，對(duì)甲酚減低；TPT組的變化較MC組的變化主要體現(xiàn)于葡萄糖和丙氨酸增強(qiáng)，對(duì)甲酚和花生四烯酸減低；TPT組的變化較艾灸組的變化主要體現(xiàn)于葡萄糖、丙氨酸、鳥氨酸、蔗糖低下，對(duì)甲酚增強(qiáng)。

表2 血清中潛在的生物標(biāo)志物信息

3 討論

艾灸為傳統(tǒng)的中醫(yī)外治方面，艾灸的繼承與發(fā)揚(yáng)，需要現(xiàn)代先進(jìn)的科學(xué)方法與技術(shù)的詮釋。代謝組學(xué)是一種具有整體水平的研究方法，符合中醫(yī)整體觀和陰陽動(dòng)態(tài)平衡觀，又與艾灸能夠整體性調(diào)節(jié)機(jī)體的作用相契合。因此，采用代謝組學(xué)方法深入的對(duì)艾灸治療RA作用機(jī)制進(jìn)行探討符合研究的實(shí)際需要，將有利于系統(tǒng)地闡釋艾灸治療RA的作用機(jī)制，同時(shí)推動(dòng)艾灸療法在臨床中的運(yùn)用。

本研究從AA大鼠血液代謝組學(xué)中發(fā)現(xiàn)，變化過程的代謝標(biāo)志物為葡萄糖、丙氨酸、鳥氨酸、對(duì)甲酚、花生四烯酸、蔗糖，其中擾動(dòng)的代謝通路主要涉及：糖類代謝、氨基酸代謝、腸內(nèi)菌群及脂肪酸代謝。

脂肪、蛋白質(zhì)和糖類為體內(nèi)三大營養(yǎng)物質(zhì)，與能量代謝密切相關(guān)。糖代謝具體包括糖酵解、有氧氧化等代謝途徑，即能提供能量為機(jī)體，又可以通過信號(hào)通路或網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)機(jī)體的生理機(jī)能。研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，糖酵解與RA的發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展密切相關(guān)，并認(rèn)為RA中糖代謝活動(dòng)增強(qiáng)從而導(dǎo)致相關(guān)基因的表達(dá)異常。

鳥氨酸是由精氨酸分解而來，而精氨酸是通過一氧化氮途徑來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，使免疫球蛋白產(chǎn)生從而在機(jī)體免疫方面起重要作用[13]。丙氨酸是葡萄糖形成過程當(dāng)中的主要物質(zhì)，而丙氨酸與葡萄糖還構(gòu)成一個(gè)循環(huán)即丙氨酸-葡萄糖循環(huán)，因此，機(jī)體從血液中吸收大量丙氨酸來促進(jìn)糖代謝為機(jī)體供能，從而加強(qiáng)自身免疫[14]。

眾所周知，許多免疫活性細(xì)胞參與RA的發(fā)病，前列腺素E2是非常重要的致炎因子、且是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物。而花生四烯酸又是白三烯的前體，白三烯B4與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)[15]，同時(shí)是體內(nèi)非常重要的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，它不僅能夠激活多種炎性和免疫效應(yīng)細(xì)胞而且能夠聚集上述細(xì)胞?，F(xiàn)代研究[17]發(fā)現(xiàn)，RA患者體內(nèi)白三烯B4的濃度明顯升高，與關(guān)節(jié)腫痛、關(guān)節(jié)破壞密切相關(guān)[16]。

對(duì)甲苯酚是苯丙氨酸于腸內(nèi)在厭氧菌群的作用下產(chǎn)生，在AA大鼠血清中發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)，說明了AA大鼠體內(nèi)腸道菌群代謝發(fā)生擾動(dòng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，AA大鼠血清中葡萄糖、丙氨酸、鳥氨酸、蔗糖低下，對(duì)甲酚、花生四烯酸增強(qiáng)；經(jīng)艾灸干預(yù)后葡萄糖增強(qiáng)，對(duì)甲酚減低；說明艾灸參與了糖類、腸道菌群及脂肪酸的代謝。而相較于TPT組來說，艾灸組葡萄糖、丙氨酸、鳥氨酸、蔗糖增強(qiáng)，對(duì)甲酚低下，說明艾灸亦參與了氨基酸代謝。

由上可見，艾灸能明顯改善RA炎癥反應(yīng)，同時(shí)能夠保護(hù)心肌，調(diào)控氨基酸、脂肪酸代謝及腸內(nèi)菌群代謝可能是艾灸治療RA的特異性體現(xiàn)。

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