參附芎澤方對心肌梗死后心力衰竭模型大鼠心肌能量代謝的影響

鐘 偉，于遠望，張淑珍，李彩紅，齊 婧，尚 俊平 ，王永剛*

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712002；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)心腦血管病研究所，陜西 咸陽 712000）

慢性心力衰竭（CHF）是各種心血管疾病終末階段的共同表現(xiàn)，再住院率和5年內(nèi)病死率居高不下，已成為急需解決的心血管病之一[1]。盡管藥物（ACEI類、β -受體阻滯劑等）和現(xiàn)代技術(shù)（心臟再同步治療、左室輔助裝置等）應(yīng)用于臨床可改善患者的臨床癥狀，但大多數(shù)患者仍將走向終末期心衰[2]。近年國內(nèi)外研究[3]表明，心肌細胞能量代謝紊亂在CHF的發(fā)生與發(fā)展中起著舉足輕重的作用。當(dāng)心肌缺血缺氧時，可出現(xiàn)葡萄糖、游離脂肪酸、乳酸、氨基酸等能量物質(zhì)代謝紊亂，而引起心肌細胞正常能量代謝途徑中的某個環(huán)節(jié)發(fā)生改變，導(dǎo)致心肌基本結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常。中醫(yī)藥具有多成分、多途徑、多靶點的作用特點，臨床防治慢性心力衰竭療效確切[4]。本實驗采用參附芎澤方干預(yù)心肌梗死后心衰大鼠，觀察其對能量代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～210 g，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（陜）2012-003。

1.2 儀器與試劑 小動物呼吸機、生物組織自動脫水機、高速臺式冷凍離心機、全自動酶標儀、全自動凝膠成像系統(tǒng)、電熱恒溫振蕩水槽、可調(diào)微量移液器。

ELISA試劑盒（CK、CK-MB、FFA）北京誠林生物科技有限公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗β-Actin單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；羊抗AMPK多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗GLUT-4多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；辣根酶標記兔抗山羊IgG，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；辣根酶標記山羊抗小鼠IgG，北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；PVDF膜，美國sigma公司。

1.3 藥物 參附芎澤方（SFXZ）由丹參10 g，黨參9 g，黃芪30 g，附子6 g，川芎10 g，澤瀉15 g等組成。由陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室制備成每1 mL含生藥量1.6 g的藥液，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 方法

1.4.1 分組與給藥 60只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、參附芎澤方藥組、曲美他嗪組，每組15只。假手術(shù)組和模型組給予純凈水，參附芎澤方藥組和曲美他嗪組分別給予相應(yīng)濃度等體積藥液，以20 mL/kg等體積溶液灌胃，1次/d，計28 d。

1.4.2 心肌梗死后心衰模型制備 大鼠稱重，采用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg，腹腔注射麻醉，仰臥位固定，四肢連接心電圖。氣管切開，連接小動物呼吸機。在大鼠胸骨左側(cè)第三四肋間開胸，剪開心包，暴露心臟，于肺動脈圓錐與左心耳之間，用6-0無創(chuàng)縫線在離LAD起始部2 mm處穿線結(jié)扎，局部心肌顏色變暗，心電圖Ⅱ?qū)?lián)J點或ST段抬高，關(guān)閉胸腔并縫合。術(shù)后青霉素鈉20萬U/d，腹腔注射，連續(xù)3 d。4周后，各組隨機選取2只大鼠檢測血流動力學(xué)和血清BNP，觀察模型是否制備成功。

1.5 觀察指標

1.5.1 ELISA法檢測大鼠血清CK、CK-MB、FFA含量 大鼠末次給藥1 h后，腹主動脈采血，4 000 r/min，離心10 min，采集上層血清，- 80 ℃保存。ELISA檢測嚴格按照實驗說明進行操作。

1.5.2 Western blot檢測心肌組織AMPK、GLUT4蛋白的表達 取左室心肌組織100 mg，加入裂解液，離心后取上清檢測組織總蛋白。根據(jù)所要分離蛋白質(zhì)的分子量配制不同濃度的分離膠，室溫下聚合，完全聚合后，移出Teflon梳子，上下槽均加入電泳緩沖液，跑膠。PVDF膜放在漂洗過的凝膠上，0.38 A轉(zhuǎn)移膜90 min，取出PVDF膜，漂洗。置于含有10 mL用封閉液稀釋的一抗（1:200、1:200、1:500）雜交袋中，封口，過夜，漂洗，將膜放入含有10 mL用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記的相應(yīng)二抗（1:5 000）的雜交袋內(nèi)，封口，搖動1 h，取等體積的ECL試劑A液、B液混合，反應(yīng)1 min，用保鮮膜覆蓋PVDF膜。覆蓋X線膠片，曝光。用凝膠圖像分析儀采集圖像，Western blot條帶用Image J軟件分析，結(jié)果以目的蛋白OD值與β-acting的OD值表示。

1.5.3 心肌組織HE染色 各組隨機取5只大鼠，取心臟后，縱向切取左室約0.3 cm×0.5 cm的心肌組織，4%甲醛固定，石蠟包埋切片，于光鏡下觀察心肌組織的病理改變。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用單因素方差分析，組間比較有顯著差異進一步行q檢驗進行兩兩比較，若方差不齊采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠血清CK、CK-MB、FFA含量的影響 見表1。

表1 對大鼠血清CK、CK-MB、FFA含量的影響（ ，n = 10）

表1 對大鼠血清CK、CK-MB、FFA含量的影響（ ，n = 10）

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與曲美他嗪組比較，▲ P＜0.05

組 別CK/（U/L）CK-MB/（U/L）FFA/（μmol/L）假手術(shù)組 923.42±75.67 41.82±5.73 298.37±12.48模型組 576.49±81.43# 27.43±2.81# 416.56±15.38#參附芎澤組 761.28±92.57△ 36.16±3.46△▲ 314.24±18.52△▲曲美他嗪組 784.62±87.65△ 31.08±3.82△ 362.37±17.59△

2.2 對大鼠心肌組織AMPK、GLUT4蛋白表達的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織AMPK、GLUT4蛋白表達均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，參附芎澤方組和曲美他嗪組大鼠心肌組織AMPK、GLUT4蛋白表達均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與曲美他嗪組比較，參附芎澤方組大鼠心肌組織AMPK蛋白表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 對大鼠心肌組織HE染色的影響 假手術(shù)組心肌結(jié)締組織結(jié)構(gòu)清晰，心肌組織肌纖維排列整齊，連接緊密，細胞核可見，細胞核大小、形態(tài)基本一致，染色質(zhì)均勻，未見肥大、壞死、萎縮、斷裂及間質(zhì)細胞增生等現(xiàn)象；模型組心肌灶狀壞死，壞死灶內(nèi)肌纖維溶解，心肌間質(zhì)水腫，并見大量炎細胞浸潤；曲美他嗪組心肌纖維局部斷裂、排列紊亂、萎縮變性及間質(zhì)纖維組織增生程度較小，有肉芽組織的形成，壞死心肌細胞減少；參附芎澤方組心肌紊亂，心肌輕微灶狀壞死，心肌纖維溶解及炎細胞浸潤不甚明顯。

3 討論

心力衰竭屬中醫(yī)“心悸”“痰飲”“喘證”“水腫”等范疇。病機為氣虛血瘀。肺、脾、腎等功能失調(diào)，痰濕、水飲、瘀毒等病理產(chǎn)物從內(nèi)而生，共同作用于心，導(dǎo)致心功能受損；而心功能降低則引起痰濕、水飲在體內(nèi)集聚形成瘀毒，進一步加重臟腑功能的損傷。從而形成因虛致實，因?qū)嵵绿?，虛實夾雜的病機核心；治療以扶正祛邪為原則，強調(diào)扶正固本，以益氣活血利水為基本方法[5-8]。

心肌正常的能量代謝是維持心臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和心肌舒縮功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)心肌缺血/缺氧時，心肌組織能量供應(yīng)的底物發(fā)生轉(zhuǎn)換，從脂肪酸β氧化轉(zhuǎn)化為葡萄糖無氧酵解為主，導(dǎo)致體內(nèi)FFA和乳酸堆積，心肌的能量供應(yīng)不足[9-10]。同時總CK活性及構(gòu)成比會發(fā)生變化，CK同工酶內(nèi)部構(gòu)成的失衡終致總CK活性下降，從而引起能量物質(zhì)轉(zhuǎn)運發(fā)生障礙[11]。心功能降低時，機體應(yīng)激性代償反應(yīng)，主要通過心肌細胞的能量代謝感受器——AMP激活的蛋白激酶（AMPK）調(diào)節(jié)組織的代謝來控制能量平衡[12]，AMPK激活作用于下游靶蛋白，GLUT-4蛋白表達增多，線粒體肌酸激酶可以快速催化PCr和ADP轉(zhuǎn)化到ATP，為心肌的收縮提供能量[13]。本實驗結(jié)果表明，參附芎澤方可增加心肌組織AMPK、GLUT-4蛋白的表達和血清CK、CK-MB含量，降低血清FFA含量，調(diào)控心肌的能量代謝。

心室重構(gòu)是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，包括心肌實質(zhì)和間質(zhì)的重塑。心肌缺血不但影響細胞功能，而且可引起膠原纖維增生，心肌重構(gòu)，壞死心肌及周圍缺血心肌組織的病理學(xué)改變導(dǎo)致心臟的正常幾何形態(tài)改變及收縮、舒張功能降低[14]。心肌梗死后非梗死區(qū)組織膠原含量升高，可加大室壁的僵硬度，降低心室順應(yīng)性，導(dǎo)致心室舒張功能不全[15]。本實驗HE染色結(jié)果顯示，心肌梗死后心衰大鼠心肌灶狀壞死，心肌間質(zhì)水腫，并見大量炎細胞浸潤。也從病理角度驗證了結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支建立心肌梗死后心衰模型成功。曲美他嗪和參附芎澤方給藥組可不同程度減輕心肌組織學(xué)改變。

本實驗結(jié)果表明，參附芎澤方可增加心肌組織AMPK、GLUT4蛋白的表達和血清CK、CK-MB含量，降低血清FFA含量，減輕心肌組織病理損傷，改善心衰。未來應(yīng)結(jié)合蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)探索參附芎澤方防治CHF的多靶點機制，為中醫(yī)藥臨床防治CHF提供依據(jù)。

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