桂枝甘草湯對(duì)運(yùn)動(dòng)性貧血大鼠血漿總超氧化物歧化酶和血清鐵的影響

傅夢(mèng)薇，韓宜臻，彭 煜，張樂怡 ，趙宇晗，胡秀華

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029）

運(yùn)動(dòng)性貧血是由于運(yùn)動(dòng)引起的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白濃度下降的一種血液疾病[1]。近年來全球運(yùn)動(dòng)性貧血檢出率平均為10%～20%，女運(yùn)動(dòng)員檢出率更高[2]。中醫(yī)認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)性貧血可歸為“心陽虛”“血虛”“萎黃”等范疇，治療本病的方劑中以補(bǔ)氣和滋陰養(yǎng)血藥物出現(xiàn)頻次最高。桂枝甘草湯首次出現(xiàn)在《傷寒論》第64條“發(fā)汗過多，其人叉手自冒心，心下悸，欲得按者，桂枝甘草湯主之”。現(xiàn)代藥理研究[3]發(fā)現(xiàn)，桂枝甘草湯有抗血栓、抗心肌缺血、抗心律失常、抗突變等作用，提示桂枝甘草湯可能與機(jī)體抗氧化酶活性有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物造模、灌胃給藥以及SOD酶活性和血清鐵離子檢測(cè)等，探討桂枝甘草湯改善大鼠運(yùn)動(dòng)性貧血的情況，及其對(duì)運(yùn)動(dòng)性貧血大鼠血漿總超氧化物歧化酶（SOD）活性和血清鐵濃度的影響，為桂枝甘草湯臨床治療運(yùn)動(dòng)性貧血的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量200 g，3～4周齡，由北京斯貝?？萍加邢薰咎峁?，合格批號(hào)：SCXK（京）2016-0002。

1.2 藥物配劑 桂枝甘草湯組成：桂枝12 g，炙甘草6 g。原藥材由同仁堂藥房提供，均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》藥材標(biāo)準(zhǔn)。稱取桂枝12 g，炙甘草6 g進(jìn)行水煎，煎煮至0.018 g/mL，分成3等份，1份備用，取其中2份濃縮至0.036 g/mL，分裝后與生理鹽水一同置于冰箱4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器 乙酰苯肼（Aladdin）、總超氧化物歧化酶檢測(cè)試劑盒（上海源葉生物科技有限公司），血清鐵檢測(cè)試劑盒（上海源葉生物科技有限公司），生理鹽水、一次性20 μL采血管、12號(hào)灌胃針、10 mL肝素鈉抗凝管（北京歐北生物科技），全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（MEK-6400），Thermo 酶標(biāo)儀（Bio-Tek美國(guó)），TDL-80-2B低速臺(tái)式離心機(jī)（飛鴿牌）。

2 方法

2.1 分組 取25只SPF級(jí)SD雄性大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為空白對(duì)照組（Control組）、乙酰苯肼組（APH組）、運(yùn)動(dòng)性貧血組（APH+S組）、桂枝甘草湯1和2組（APH+S+GGD 1和2組），每組5只。觀察大鼠健康狀態(tài)，稱量體質(zhì)量。

2.2 模型制備及給藥 除Control組注射生理鹽水外，按照100 mg/kg對(duì)其余組大鼠進(jìn)行腹腔注射2%乙酰苯肼。然后將APH+S、APH+S+GGD 1組及APH+S+GGD 2組大鼠均進(jìn)行2周30 min力竭游泳運(yùn)動(dòng)（若不能游完30 min，則將大鼠沉入水底10 s后視為力竭，可撈出）[4-5]。用12號(hào)大鼠灌胃器對(duì)運(yùn)動(dòng)性貧血組（APH+S）每日灌胃生理鹽水，對(duì)APH+S+GGD 1組及2組大鼠每日分別灌胃0.018、0.036 g/mL濃度的桂枝甘草湯藥液。藥液濃度計(jì)算方法：按人體每50 kg體質(zhì)量每日需要18 g桂枝甘草（12 g桂枝與6 g炙甘草）計(jì)算，即0.36 g/kg按質(zhì)量等比換算后，200 g大鼠每日需用0.072 g桂枝甘草，該體質(zhì)量大鼠胃容量為5 mL，故綜合考慮以3 mL的藥液灌胃為宜，藥液濃度應(yīng)為0.018 g/mL，加倍濃度則為0.036 g/mL。

2.3 檢測(cè)指標(biāo) 1）大鼠紅細(xì)胞參數(shù)：將眼后靜脈叢采血法取到的大鼠靜脈血送檢，采用全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定血液中紅細(xì)胞等相關(guān)參數(shù)。2）總超氧化物歧化酶活性：按總SOD檢測(cè)試劑盒（NBT核黃素比色法，R21667，上海源葉生物科技有限公司）說明書進(jìn)行。3）血清鐵：參考鐵檢測(cè)試劑盒（亞鐵嗪微板法，R21668，上海源葉生物科技有限公司）說明書進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)分析均通過SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件完成。正態(tài)分布的資料應(yīng)用t檢驗(yàn)和χ2分析比較差異。數(shù)據(jù)均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)運(yùn)動(dòng)性貧血大鼠一般體征的影響 與空白對(duì)照組大鼠相比，APH、APH+S組大鼠表現(xiàn)出倦怠、倦臥少動(dòng)、拱背、瞼結(jié)膜蒼白、唇色淡白、體質(zhì)量略減輕、食欲下降，而APH+S+GGD 1組和APH+S+GGD 2組大鼠上述癥狀都有顯著改善，較APH、APH+S組大鼠好動(dòng)、拱背減輕，每日需要更多維持飼料。

3.2 對(duì)運(yùn)動(dòng)性貧血大鼠的主要紅細(xì)胞參數(shù)的影響 見表1。

表1 對(duì)運(yùn)動(dòng)性貧血大鼠主要紅細(xì)胞參數(shù)的影響（ ，n = 5）

表1 對(duì)運(yùn)動(dòng)性貧血大鼠主要紅細(xì)胞參數(shù)的影響（ ，n = 5）

注：與Control組比較，# P＜0.05；與APH組比較，△P＜0.05； 與APH+S 組比較，▲P＜0.05

組 別 RBC/（個(gè)/L） Hb/（g/L） MCV/fl MCH/pg MCHC/（g/L）Control組 7.82±0.56 174.00±7.13 62.20±3.11 359.00±4.69 22.32±1.06 APH 組 6.46±0.13# 161.00±1.00# 69.95±1.25# 356.50±1.50# 24.95±0.35#APH+S組 6.79±0.06#△ 170.00±3.74#△ 70.14±2.81# 357.40±6.77# 25.04±0.69#APH+S+GGD 1 組 6.88±0.40# 168.80±8.89# 68.76±1.37# 357.40±3.88# 24.56±0.33#APH+S+GGD 2組 7.21±0.19△▲ 169.20±6.68# 66.66±1.95# 352.00±4.43△▲ 23.46±0.75#▲

3.3 對(duì)運(yùn)動(dòng)性貧血大鼠血漿總SOD活性和血清鐵濃度的影響 見表2。

表2 對(duì)運(yùn)動(dòng)性貧血大鼠血漿總SOD活性和血清鐵濃度的影響（ ，n = 5）

表2 對(duì)運(yùn)動(dòng)性貧血大鼠血漿總SOD活性和血清鐵濃度的影響（ ，n = 5）

注：與Control組比較，# P＜0.05；與APH組比較，△P＜0.05； 與APH+S 組比較，▲P＜0.05

組 別總SOD活性/（U/L）血清鐵濃度/ （μmol/L）Control組 11.179 7±3.241 1 20.986 3±3.674 2 APH 組 6.294 7±4.682 1# 29.276 0±7.307 7 APH+S組 3.208 9±1.796 4# 38.966 6±9.538 9#APH+S+GGD 1組 12.462 7±4.555 6△▲ 18.175 8±4.193 2△▲APH+S+GGD 2組 9.947 9±4.651 4▲ 19.436 2±4.202 0▲

4 討論

對(duì)于運(yùn)動(dòng)性貧血[6-7]，須要遵循溫通心陽的治則，桂枝甘草湯方中桂枝作為君藥，可充分發(fā)揮其溫通心陽的作用。炙甘草補(bǔ)益心陽，益氣生血[8]，兩藥合用，共奏溫通心陽、益氣生血之功。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從主要紅細(xì)胞參數(shù)來看，APH+S+GGD 1組和APH+S+GGD 2組紅細(xì)胞、血紅蛋白較APH、APH+S組均明顯提高，說明桂枝甘草湯可以明顯改善運(yùn)動(dòng)性貧血所致的紅細(xì)胞減少，起到抗運(yùn)動(dòng)性貧血的作用。血漿總SOD是臨床上觀察生物體內(nèi)清除氧自由基的首要物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)能損傷所有的生物化學(xué)復(fù)合物，與貧血時(shí)紅細(xì)胞破壞有關(guān)，血漿SOD的功能在于歧化O2-為H2O2，H2O2在過氧化氫酶的作用下分解為H2O和O2，起保護(hù)紅細(xì)胞作用[9]。早期貧血時(shí)機(jī)體為抵抗貧血，血漿總SOD活性會(huì)代償性增高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，APH+S+GGD 1組和APH+S+GGD 2組大鼠與APH和APH+S組相比，血漿總SOD活性明顯降低，說明桂枝甘草湯具有緩解血漿總SOD代償性增高的作用，間接反映出其具有與SOD類似的對(duì)紅細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用。血清鐵主要與運(yùn)鐵蛋白結(jié)合成血紅素鐵，參與血紅蛋白的攜氧功能。運(yùn)動(dòng)性貧血時(shí)血紅蛋白破壞過多，血清鐵濃度升高，攜氧功能下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與APH+S組大鼠血清鐵濃度比較，APH+S+GGD 1組和APH+S+GGD 2組血清鐵濃度回升，甚至超過空白對(duì)照組，說明桂枝甘草湯可減少血中游離鐵，增加含鐵血紅素，進(jìn)一步增強(qiáng)血紅蛋白攜氧的能力[10-11]。

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