連續(xù)性血液透析濾過對(duì)急性重癥胰腺炎大鼠腸上皮細(xì)胞凋亡和腸功能障礙的影響

王 鋒，劉 杰,黃仲俊

(1. 湖北省丹江口市第一醫(yī)院,湖北 丹江口 442700；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)屬于臨床中發(fā)生率較高的急危重癥之一，具有發(fā)病迅速、疾病進(jìn)展快、致死率高等特點(diǎn)[1]。SAP發(fā)病不僅限于胰腺本身，往往還會(huì)累及包括腸道在內(nèi)的全身多個(gè)臟器，腸黏膜屏障功能受損，表現(xiàn)為細(xì)胞非正常凋亡增加，而上皮細(xì)胞增殖與凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡決定了腸黏膜上皮功能能否處于穩(wěn)定狀態(tài)[2-3]。已有報(bào)道指出，連續(xù)性血液透析濾過能夠非選擇性的清除炎癥遞質(zhì)，保持血流動(dòng)力學(xué)處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，用于治療多臟器功能不全等疾病療效較好[4-5]。本研究通過將5%?；悄懰徕c逆行注射于大鼠膽管制備SAP模型后采取連續(xù)性血液透析濾過進(jìn)行干預(yù)，旨在探討連續(xù)性血液透析濾過對(duì)SAP大鼠腸上皮細(xì)胞凋亡和腸功能障礙的影響。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選擇SPF級(jí)SD大鼠54只，體質(zhì)量280～300 g。將54只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、血液透析濾過組，每組18只。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 術(shù)前全部大鼠禁食12 h，自由飲水；腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠；固定、消毒、上腹正中切口剖腹，于十二指腸內(nèi)側(cè)見片狀分布的胰腺，模型組和血液透析濾過組用無損傷動(dòng)脈夾夾閉肝門部膽管，從膽胰管開口十二指腸系膜緣對(duì)側(cè)腸壁穿刺扎入導(dǎo)管，導(dǎo)管插入膽胰管約1 cm，逆行注射5%?；悄懰徕c溶液(0.1 mL/100 g， 0.1 mL/min)，推注完畢后用無損傷動(dòng)脈夾夾閉。10 min后，去除動(dòng)脈夾，縫合。假手術(shù)組僅做剖腹術(shù)，并輕翻動(dòng)胰腺組織后關(guān)腹。關(guān)腹后，假手術(shù)組和模型組大鼠皮下注射生理鹽水。血液透析濾過組大鼠術(shù)后立刻給予連續(xù)性血液透析濾過12 h，方法：采用智能化床旁腎臟替代治療機(jī)(瑞典PRISMA-TM型)和AN-69型血濾器(可濾分子范圍20～30 000 D，膜面積0.9 m2)，選用股靜脈留置單針雙腔導(dǎo)管建立血管通路，透析液流速2 500 mL/h，血流量180 mL/min，置換液流速2 000 mL/h；采用濾器前肝素抗凝法，用生理鹽水(含5 000 IU/L肝素)1.5 L預(yù)沖，首次肝素劑量1 000 IU/kg，后續(xù)肝素劑量2 kIU/h。

1.3檢測(cè)指標(biāo) 分別于術(shù)后12 h、24 h、48 h每組各處死6只大鼠，取門靜脈血，采用鱟試劑定量動(dòng)態(tài)比濁法檢測(cè)血漿內(nèi)毒素含量；取腸黏膜組織，采用免疫組化法檢測(cè)凋亡因子Apaf-1、Bcl-2陽性表達(dá)率和腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)；取各組大鼠胰腺、腹水、腸系膜淋巴結(jié)以及肝臟組織，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。上述操作全部遵循無菌原則。

2 結(jié) 果

2.13組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡因子表達(dá)情況 假手術(shù)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)Apaf-1、Bcl-2陽性表達(dá)率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。術(shù)后12 h，模型組和血液透析濾過組Apaf-1陽性表達(dá)率均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，Bcl-2陽性表達(dá)率均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)；隨著距離手術(shù)時(shí)間的增加，模型組和血液透析濾過組Apaf-1陽性表達(dá)率均呈下降趨勢(shì)，但仍高于假手術(shù)組(P均<0.05)；Bcl-2陽性表達(dá)率呈增高趨勢(shì)，但仍低于假手術(shù)組(P均<0.05)。血液透析濾過組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)Apaf-1陽性表達(dá)率均明顯低于模型組(P均<0.05)，Bcl-2陽性表達(dá)率均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)Apaf-1、Bcl-2陽性表達(dá)率比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.23組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 假手術(shù)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；模型組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯高于假手術(shù)組與血液透析濾過組(P均<0.05)；隨著距離手術(shù)時(shí)間的增加，模型組和血液透析濾過組腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)均呈下降趨勢(shì)；術(shù)后24 h、48 h，血液透析濾過組腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 3組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

注：①與模型組比較，P<0.05。

2.33組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)門靜脈血漿內(nèi)毒素含量比較 假手術(shù)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)門靜脈血漿內(nèi)毒素含量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；模型組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)門靜脈血漿內(nèi)毒素含量均明顯高于假手術(shù)組與血液透析濾過組(P均<0.05)；隨著距離手術(shù)時(shí)間的增加，血液透析濾過組血漿內(nèi)毒素含量呈下降趨勢(shì)，術(shù)后24 h、48 h時(shí)血漿內(nèi)毒素含量與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 3組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)門靜脈血漿內(nèi)毒素含量比較

注：①與模型組比較，P<0.05。

2.43組大鼠各時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌培養(yǎng)情況比較 假手術(shù)組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)菌；在胰腺、腹水、腸系膜淋巴結(jié)以及肝臟中，血液透析濾過組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌培養(yǎng)陽性率均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表4。

表4 模型組與血液透析濾過組大鼠各時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌培養(yǎng)陽性率比較 %

注：①與模型組比較，P<0.05。

3 討 論

SAP發(fā)病兇險(xiǎn)，機(jī)體處在嚴(yán)重的應(yīng)激狀態(tài)下，氧自由基、繼發(fā)腸道缺氧缺血以及各種炎癥因子大量生成，破壞了腸黏膜上皮，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能損傷[6]；且SAP發(fā)生后往往伴隨持久且嚴(yán)重的腸麻痹，而細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)氣以及腸內(nèi)容物的停滯可導(dǎo)致腸內(nèi)壓力增高，造成黏膜血流降低以及黏膜損傷，具體表現(xiàn)在腸黏膜的形態(tài)學(xué)發(fā)生變化、腸黏膜通透性增加以及腸道細(xì)菌與內(nèi)毒素發(fā)生移位[7-9]。其中腸黏膜屏障功能損傷的主要分子生物學(xué)基礎(chǔ)之一即腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡增加。在線粒體的凋亡過程中，Apaf-1是其中主要的促凋亡因子之一。死亡刺激直接誘導(dǎo)線粒體內(nèi)膜間的細(xì)胞色素C釋放入胞質(zhì)中，胞漿中的Apaf-1與細(xì)胞色素C相結(jié)合，Apaf-1寡聚化后募集procaspase-9，共同組成凋亡體，最終引起細(xì)胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的凋亡[10-11]。Bcl家族蛋白在細(xì)胞凋亡過程中扮演著重要角色，其中Bcl-2是線粒體凋亡過程中主要抑凋亡因子之一，其可通過在線粒體質(zhì)膜上結(jié)合，對(duì)線粒體起到穩(wěn)定作用[12]。

本研究結(jié)果顯示，術(shù)后12 h，模型組和血液透析濾過組Apaf-1陽性表達(dá)率和腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯高于假手術(shù)組、Bcl-2陽性表達(dá)率明顯低于假手術(shù)組，說明在SAP早期腸黏膜上皮細(xì)胞即發(fā)生了嚴(yán)重凋亡；隨著距離手術(shù)時(shí)間的增加，模型組和血液透析濾過組Apaf-1陽性表達(dá)率和腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)呈下降趨勢(shì)，Bcl-2陽性表達(dá)率呈增加趨勢(shì)，血液透析濾過組腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)接近假手術(shù)組。血液透析濾過組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)門靜脈血漿內(nèi)毒素含量和胰腺、腹水、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟中細(xì)菌培養(yǎng)陽性率均明顯低于模型組，說明腸黏膜屏障功能出現(xiàn)障礙時(shí)，其腸上皮細(xì)胞之間的間隙增加，最終發(fā)生細(xì)菌以及內(nèi)毒素移位，而給予連續(xù)性血液透析濾過干預(yù)可明顯緩解腸道內(nèi)毒素以及細(xì)菌移位情況。

綜上所述，連續(xù)性血液透析濾過能夠抑制急性重癥胰腺炎大鼠腸上皮細(xì)胞通透性，可有效改善腸功能障礙，并具有抑制內(nèi)毒素與細(xì)菌移位的作用。連續(xù)性血液透析濾過改善腸功能的作用機(jī)制可能是其可清除腸道內(nèi)的內(nèi)毒素以及細(xì)菌，從而調(diào)節(jié)腸道內(nèi)部微生態(tài)的失衡，保障了腸道機(jī)械屏障的完整。

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