溫陽振衰顆粒對阿霉素致心肌細(xì)胞損傷MEF2表達(dá)的影響

蔡虎志，王笑瑩，陳青揚(yáng)，陳新宇

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2. 貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550000)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各種心臟疾病進(jìn)展至嚴(yán)重階段而引起的一種復(fù)雜的臨床綜合征，在心血管研究領(lǐng)域中，無論對于西醫(yī)還是中醫(yī)，其都是一種難以預(yù)防和治療的疾病[1]。其發(fā)病率高，有臨床癥狀的患者5年存活率與惡性腫瘤相仿[2]。據(jù)現(xiàn)有資料估測，該病總患病率為0.4%～2%，其中老年人患病率接近10%，該病一旦確診，患者5年內(nèi)生存率男性僅25%，女性僅38%[3]。胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的一種非典型通路，主要定位于胞質(zhì)，接受細(xì)胞外傳來的信號并由其上游激酶MEK5激活。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ERK5磷酸化蛋白具有顯著的心肌保護(hù)特點(diǎn)[4]，而其下游關(guān)鍵調(diào)控基因肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(Myocyte enhancer factor 2, MEF2)在慢性心力衰竭的病理過程中具有怎樣的表達(dá)特點(diǎn)與規(guī)律，溫陽振衰顆粒是否通過ERK5下游通路調(diào)控蛋白MEF2的表達(dá)從而產(chǎn)生治療作用尚不清楚，故筆者設(shè)計(jì)并完成了本實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1H9C2心肌細(xì)胞株的傳代培養(yǎng) H9C2心肌細(xì)胞傳代在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行，當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底壁時(shí)，加入含EDTA 0.25%胰蛋白酶至培養(yǎng)瓶中，同時(shí)使用吸管輕輕吹打?qū)①N壁的細(xì)胞吹下，制成單細(xì)胞溶液，取少許剩余的細(xì)胞懸液稀釋后計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度至合適的比例，種板后繼續(xù)培養(yǎng)，用于下一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2含藥血清的制備 用蒸餾水將溫陽振衰顆粒(由附子、干姜、甘草、紅參等組成)1.44 g/(kg·d)配成6 mL溶液給大鼠灌胃[4]，每日2次，每次3 mL，連續(xù)灌胃7 d后腹主動(dòng)脈取血。3 000 r/min離心，取上清，抽濾除菌后分裝，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3心肌細(xì)胞損傷的誘導(dǎo) 向H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入阿霉素(ADR)，將濃度配制為2.67 μmol/L，培養(yǎng)44 h[5]。

1.4分組 實(shí)驗(yàn)分別為正常對照組、H9C2損傷組、5%含藥血清組和10%含藥血清組，每6孔細(xì)胞為一組，將H9C2心肌細(xì)胞種于6孔板。H9C2損傷組的培養(yǎng)基中加入2.67 μmol/L的ADR，兩含藥血清組培養(yǎng)基中加入2.67 μmol/L的ADR和5%，10%的溫陽振衰顆粒含藥血清，共培養(yǎng)44 h。

1.5心肌細(xì)胞存活率檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集心肌細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以20 μL/mL的標(biāo)準(zhǔn)向各培養(yǎng)基中加入MTT溶液，吸取經(jīng)MTT培養(yǎng)后各組細(xì)胞的上清液，再向其中加入DMSO溶解液，每孔加入150 μL，而后將培養(yǎng)板放置在搖床上進(jìn)行振蕩，速度需低，時(shí)間為10 min，以使每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)的結(jié)晶物質(zhì)都得到充分溶解。最后在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量培養(yǎng)板中各組細(xì)胞的吸光度。

1.6p-MEF2與MEF2表達(dá)檢測 采用Western-blot檢測，即將50 μg心肌細(xì)胞總蛋白加入2×SDS上樣緩沖液，100 ℃變性8 min，上樣，恒定電流，前15 min 16 mA/gel電泳，然后32 mA/gel電泳至底部。電轉(zhuǎn)印按照膜面積0.8 mA/cm2設(shè)定電流，轉(zhuǎn)膜2 h。分別加入一抗，4 ℃過夜。加入酶標(biāo)二抗，室溫雜交2 h。TBST漂洗10 min×3次。ECL曝光顯像，掃描，保存，分析。

2 結(jié) 果

2.1各組H9C2心肌細(xì)胞存活率比較 正常對照組心肌細(xì)胞存活率為(91.85±5.52)%，H9C2損傷組為(31.63±4.72)%，5%含藥血清組為(47.52±4.64)%，10%含藥血清組為(58.94±4.13)%。各損傷組細(xì)胞存活率均明顯低于正常對照組(P均<0.05)，5%含藥血清組和10%含藥血清組均明顯高于H9C2損傷組(P<0.05)，且10%含藥血清組明顯高于5%含藥血清組(P<0.05)。

2.2各組H9C2心肌細(xì)胞p-MEF2與MEF2表達(dá)情況 各損傷組H9C2心肌細(xì)胞p-MEF2表達(dá)量均明顯低于正常對照組(P均<0.05)，5%含藥血清組和10%含藥血清組均明顯高于H9C2損傷組(P均<0.05)，且10%含藥血清組明顯高于5%含藥血清組(P均<0.05)。各組間H9C2心肌細(xì)胞MEF2表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1及圖1。

表1 各組H9C2心肌細(xì)胞p-MEF2與MEF2的表達(dá)

注：①與正常對照組比較，P<0.05；②與H9C2損傷組比較，P<0.05；③與5%含藥血清組比較，P<0.05。

圖1 各組H9C2心肌細(xì)胞p-MEF2與MEF2表達(dá)情況

3 討 論

MEF2屬于MADS蛋白家族，在心肌中高表達(dá)[6]。已發(fā)現(xiàn)的脊椎動(dòng)物 MEF2 亞型有MEF2A、MEF2B、MEF2C、MEF2D[7]，心肌中主要亞型為MEF2A和MEF2D[8]。MEF2與活性組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)正相關(guān)[9]，與組蛋白去乙?；?HDACs)負(fù)相關(guān)。HDAC4或5上有1個(gè)MEF2?？繀^(qū)域，Ca2+-CaM或伴侶蛋白14-3-3結(jié)合至該區(qū)域可解除HDAC對MEF2的抑制作用，使MEF2釋放并通過與其他因子的相互作用起始肥厚基因轉(zhuǎn)錄。MEF2基因失活可致心臟發(fā)育停止，ANP基因表達(dá)下調(diào)[10]，缺乏MEF2的小鼠表現(xiàn)出非正常的心臟功能，但可抵抗壓力誘導(dǎo)的心臟重塑(如心肌肥厚)[11]。MEF2A或者M(jìn)EF2C相關(guān)的肥厚心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并不隨鈣調(diào)磷蛋白磷酸酶的活化而進(jìn)一步變化，表明MEF2因子誘發(fā)心肌細(xì)胞肥大的過程相對獨(dú)立，不受鈣調(diào)磷蛋白磷酸酶的調(diào)節(jié)[12]。MEF2首先調(diào)節(jié)某些心肌細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位、細(xì)胞骨架的重塑和線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的完整性，并最終造成心力衰竭過程中常見的心臟管腔擴(kuò)張、增生和心肌收縮功能失調(diào)[13]。MEF2活性可受ERK5調(diào)節(jié)，ERK5結(jié)合于MEF2的MADS結(jié)構(gòu)域，能夠磷酸化MEF2A、MEF2C和MEF2D的順式激活結(jié)構(gòu)域而提高轉(zhuǎn)錄活性。ERK5對MEF2C順式激活結(jié)構(gòu)域的磷酸化作用是通過對c-jun表達(dá)的刺激作用而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。此外，ERK5含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，這表明ERK5作為輔激活因子募集基本轉(zhuǎn)錄器而激活MEF2依賴的轉(zhuǎn)錄[14]。這兩個(gè)機(jī)制都適用于ERK5對MEF2活性的調(diào)節(jié)。

溫陽振衰顆粒是由本課題組研發(fā)的湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，其基本組方在醫(yī)院門診及住院部已經(jīng)安全、有效地使用了8年余。其組方中附子溫腎陽，干姜補(bǔ)脾陽，二者一走一守，扶陽破陰，逐寒救逆[15]。炙甘草調(diào)和補(bǔ)虛，被廣泛應(yīng)用于急慢性心功能不全、冠心病、心律不齊等，也用于溫陽化氣，治療心源性或腎源性水腫[16]。在四逆湯基礎(chǔ)上加紅參可溫陽補(bǔ)氣、復(fù)脈固脫，如虞摶說附子“能引人參……以追復(fù)其失散之元陽……”[17]，不僅有回陽救逆之效，又增溫經(jīng)通絡(luò)之能。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)，溫陽振衰顆粒在有效改善慢性心力衰竭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物癥狀的同時(shí)可以顯著上調(diào)心肌ERK5蛋白磷酸化的表達(dá)[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溫陽振衰顆?？梢哉{(diào)控ERK5蛋白的關(guān)鍵下游靶基因MEF2蛋白磷酸化的表達(dá)，這可能是其治療慢性心力衰竭的重要機(jī)制之一，但具體調(diào)控模式尚需進(jìn)一步研究。

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