抗寒甘藍(lán)型油菜的初步選育

文靜 熊秋芳 傅廷棟 沈金雄

摘要：為將白菜型油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ L.）中的抗寒性狀轉(zhuǎn)育到甘藍(lán)型油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ L.）中，以３個(gè)甘藍(lán)型油菜品系為母本，４個(gè)抗寒白菜型油菜品種為父本配制雜交組合，研究了各雜交組合回交親和性以及雜種的形態(tài)表現(xiàn)。結(jié)果表明：①甘白種間雜交親和性較高，親和指數(shù)最高的組合達(dá)３．４２，最低為０．５０；②雜交親和性受雙親基因型的影響，且母本基因型對雜交親和指數(shù)的影響大于父本基因型；③利用ＳＳＲ鑒定真假雜種，真雜種葉片形態(tài)特征介于雙親之間，根系形態(tài)偏向于白菜型油菜，具有粗壯的主根而須根較少。通過測配可選出雜交親和性較高的甘白組合，從而繁殖出較多的雜交及回交分離后代用于下一步的田間抗寒性鑒定和篩選。

關(guān)鍵詞：強(qiáng)冬性白菜型油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ L.）；甘藍(lán)型油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ L.）；抗寒性；選育；種間雜交

中圖分類號(hào)：Ｓ６０３．４；Ｓ３３２．５文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）15－3167-04

Ｐｒｉｍａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｃｏｌｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ

ＷＥＮ Ｊｉｎｇ，ＸＩＯＮＧ Ｑｉｕ－ｆａｎｇ，ＦＵ Ｔｉｎｇ－ｄｏｎｇ，ＳＨＥＮ Ｊｉｎ－ｘｉｏｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅ ｃｏｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｒａｉｔ ｆｒｏｍ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｉｎｔｏ Ｂ． ｎａｐｕｓ， ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ ａｎｄ ｂａｃｋｃｒｏｓｓ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｍｏｎｇ ｔｈｒｅｅ Ｂ． ｎａｐｕｓ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｆｏｕｒ Ｂ． ｒａｐａ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｃｏｌｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｅｒｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｍｏｎｇ ｔｈｅｓｅ ｔｗｅｌｖｅ ｃｒｏｓｓｅｓ， ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｎｄ ｌｏｗｅｓｔ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｉｎｄｅｘ ｗａｓ ３．4２ ａｎｄ ０．５０， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂ． ｎａｐｕｓ ａｎｄ Ｂ． ｒａｐａ ｗａｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔｓ； ａｎｄ Ｂ． ｎａｐｕｓ， ａｓ ｔｈｅ ｆｅｍａｌｅ ｐａｒｅｎｔ， ｈａｄ ｌａｒｇｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｈａｎ Ｂ． ｒａｐａ． Ｔｈｅ ｔｒｕｅ ｈｙｂｒｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒａｉｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔｓ ｅｘｃｅｐｔ ｔｈａｔ ｉｔ ｈａｄ ｓｔｏｕｔ ａｘｉａｌ ｒｏｏｔｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ｂ． ｒａｐａ． Ｉｔ ｗａｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｃｒｏｓｓｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｏｕｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｒｏａｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｏ ｔｈａｔ ｍｏｒｅ ｃｒｏｓｓ ａｎｄ ｂａｃｋｃｒｏｓｓ ｐｒｏｇｅｎｉｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｏｒ ｃｏｌｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｔｒｏｎｇ ｗｉｎｔｅｒ Ｂrassica ｒａｐａ； Ｂ． ｎａｐｕｓ； ｃｏｌｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ； ｂｒｅｅｄｉｎｇ； ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ目前，我國食用植物油年產(chǎn)量約１ ０００萬ｔ，自給率不足４０％。油菜是我國第一大油料作物，年種植面積約６７０萬ｈｍ２［１］，年產(chǎn)油量約４５０～５００萬ｔ，占自產(chǎn)食用植物油總量的５０％左右。進(jìn)一步發(fā)展油菜生產(chǎn)可以從一定程度上緩解我國食用植物油供需矛盾。

在保證糧棉面積的情況下擴(kuò)大油菜生產(chǎn)，其中一個(gè)重要的舉措就是提高復(fù)種指數(shù)。我國北方旱寒區(qū)多為“兩季不足，一季有余”的地區(qū)，夏作物收獲后至翌年春播前，有大量土地冬閑，利用冬閑田發(fā)展油菜生產(chǎn)可以提高土地資源利用率，從而提高單位土地面積產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)也增加了冬春季節(jié)的植被覆蓋率，減少沙塵源，具有較好的生態(tài)效益。甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)篩選了一批能夠在低溫－３２～

－２５ ℃條件下安全越冬、適應(yīng)北方旱寒區(qū)種植的冬油菜新品種，如隴油６、７、８、９號(hào)。這些冬油菜品種大多為強(qiáng)冬性白菜型油菜，品質(zhì)雙高（高芥酸、高硫苷），而甘藍(lán)型油菜品種比白菜型油菜豐產(chǎn)性更好、品質(zhì)更優(yōu)，如能將強(qiáng)冬性白菜型油菜的抗寒性轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜中來，選育抗寒、雙低的甘藍(lán)型油菜，則可改良目前抗寒冬油菜的品質(zhì)，提高冬油菜產(chǎn)量，從而進(jìn)一步擴(kuò)大油菜生產(chǎn)。另一方面，近年來極端災(zāi)害氣候頻繁，如２００８年春的冰雪天氣，為保證南方冬油菜區(qū)的生產(chǎn)安全，也迫切需要選育抗寒性較強(qiáng)的甘藍(lán)型油菜。

本研究在幾個(gè)強(qiáng)抗寒白菜型油菜與雙低甘藍(lán)型油菜間配制雜交組合，并對雜種進(jìn)行分子標(biāo)記和形態(tài)學(xué)鑒定，旨在初步分析抗寒白菜型油菜與甘藍(lán)型油菜雜交親和性，為選育抗寒甘藍(lán)型油菜品系奠定基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

試驗(yàn)材料包括３個(gè)雙低甘藍(lán)型油菜恢復(fù)系６－３５２０、６－６３３７與Ｐ２０，６－３５２０為瑞典引進(jìn)的冬性甘藍(lán)型油菜，６－６３３７與Ｐ２０由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究室提供；抗寒白菜型油菜品種隴油６號(hào)、隴油８號(hào)、隴油９號(hào)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，天油２號(hào)由天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

１．２方法

１．２．１田間雜交試驗(yàn)材料于２００９年１０月播種于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)試驗(yàn)基地。２０１０年３月，以甘藍(lán)型油菜為母本、白菜型油菜為父本，采取蕾期人工剝蕾授粉的方式，共配制１２個(gè)雜交組合，成熟時(shí)按組合收獲。各組合雜種于２０１０年１０月播種。２０１１年３月，經(jīng)分子標(biāo)記和形態(tài)學(xué)鑒定之后，各組合真雜種與甘藍(lán)型油菜親本回交得到ＢＣ１代。

１．２．２雜交親和性評(píng)價(jià)方法雜交或回交之后，記載各組合授粉花蕾數(shù)，收獲后按組合記錄結(jié)角數(shù)和結(jié)實(shí)數(shù)，并計(jì)算結(jié)角率、每角粒數(shù)和親和指數(shù)。雜交親和性的高低以親和指數(shù)來衡量。各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

結(jié)角率＝結(jié)角數(shù)／授粉花蕾數(shù)×１００%；

每角粒數(shù)＝結(jié)實(shí)數(shù)／結(jié)角數(shù)；

親和指數(shù)＝結(jié)實(shí)數(shù)／授粉花蕾數(shù)。

１．２．３雜種的分子標(biāo)記鑒定待田間材料３～５片真葉時(shí)，取各組合親本及雜種的幼嫩葉片，每個(gè)組合隨機(jī)?。磦€(gè)雜種單株幼嫩葉片，ＣＴＡＢ法提取ＤＮＡ［２］。用０．８％的瓊脂糖凝膠電泳檢測ＤＮＡ質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)測其濃度。各樣品ＤＮＡ最終濃度稀釋到５０ ｎｇ，儲(chǔ)藏于－２０ ℃冰箱待用。

ＳＳＲ 引物序列來源于Ｐｉｑｕｅｍａｌ等［３］（前綴為ＢＲＡＳ和ＣＢ）公布的序列。ＰＣＲ反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照陸光遠(yuǎn)等［４］的方法，先在各組合親本間篩選到２～３對能將兩個(gè)親本明確區(qū)分的共顯性ＳＳＲ標(biāo)記，所選標(biāo)記用于各組合真假雜種鑒定。

１．２．４雜種形態(tài)學(xué)特征考察２０１１年２月田間材料５～７片真葉時(shí)，對各組合雙親與雜種地上及地下部分進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，比較雜種與親本形態(tài)學(xué)方面的異同。

２結(jié)果與分析

２．１甘藍(lán)型油菜與抗寒白菜型油菜雜交親和性

由表１可以看出，各雜交組合親和指數(shù)是不同的，組合６－６３３７×隴油６號(hào)親和指數(shù)最高，為３．４２，６－３５２０×隴油９號(hào)親和指數(shù)最低，僅０．５０，說明甘白種間雜交親和性與父母本的基因型有關(guān)。以同一甘藍(lán)型油菜為母本、不同的白菜型油菜為父本配制雜交組合，各個(gè)組合間親和指數(shù)相對來說差異不大，以Ｐ２０為母本的組合親和指數(shù)在１．３７～１．７５之間，以６－６３６７為母本的組合親和指數(shù)在１．５０～３．４２之間，以６－３５２０為母本的組合親和指數(shù)在０．５０～０．７7之間。以同一白菜型油菜為父本，不同甘藍(lán)型油菜為母本配制的雜交組合間，各組合親和指數(shù)差異很大。方差分析結(jié)果表明，不同的母本（甘藍(lán)型油菜）基因型間親和指數(shù)差異達(dá)到極顯著水平，不同的父本（白菜型油菜）基因型間差異不顯著。結(jié)果表明，雖然甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜的基因型均對甘白種間雜交親和性有影響，但母本甘藍(lán)型油菜基因型的影響起主要作用。

以甘藍(lán)型油菜６－６３３７為母本配置的雜交組合，其平均親和指數(shù)高于其他組合。其中每角粒數(shù)最高的組合為６－６３３７×隴油８號(hào)，達(dá)到６．３２粒/角。以６－３５２０為母本配制的各組合結(jié)角率最低，僅１５．５８%～２４．０１％，且這些組合平均親和指數(shù)極顯著低于其他組合。３個(gè)甘藍(lán)型油菜品系與各抗寒白菜型油菜的雜交親和力從大到小依次為６－６３３７、Ｐ２０、６－３５２０。

２．２雜種的分子標(biāo)記鑒定結(jié)果

為篩選到能將甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜明確區(qū)分的共顯性ＳＳＲ標(biāo)記，我們首先用各親本對８０對ＳＳＲ引物進(jìn)行了篩選。每個(gè)組合篩選出２～３對帶型清晰、多態(tài)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)的共顯性標(biāo)記，用于真假雜種鑒定。雜種帶型統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，除組合Ｐ２０×天油２號(hào)的１個(gè)雜種外（圖１ａ），其他組合隨機(jī)選取的４個(gè)雜種Ｆ１單株均為真雜種。例如組合Ｐ２０×隴油６號(hào)，各雜種均能同時(shí)擴(kuò)增出雙親的帶型（圖１ｂ）。此外，用引物ＣＢ１００９９檢測組合０６－６３３７×隴油９號(hào)的雜種，發(fā)現(xiàn)４個(gè)Ｆ１單株能擴(kuò)增出大部分的父本帶型，而丟失了父本的１條帶（圖１ｃ）；而該組合雜種經(jīng)其他引物檢測證明４個(gè)雜種均為真雜種（圖１ｄ），說明此組合雜交種在引物ＣＢ１００９９附近發(fā)生了交換。

２．３雜種Ｆ１代形態(tài)特征

甘藍(lán)型油菜和抗寒白菜型油菜所得雜交種子出苗較好，雜種苗期生長健壯，從苗期到初花期均表現(xiàn)出雙親中間類型，生長勢強(qiáng)于雙親?？购撞诵陀筒说闹鞲謮?，須根少（圖２ａ），甘藍(lán)型油菜的主根較細(xì)，須根多（圖２ｂ），而甘白雜交所得Ｆ１的根系表型介于雙親之間，偏向于白菜型親本根系，有較為粗壯的主根，也有少量須根（圖２ｃ）。在甘肅種植，抗寒白菜型油菜于冬季地上部分避害型失綠枯萎，與此同時(shí)，主根不斷增長，根莖加粗，根的鮮重和干重增加，第二年開春后，下陷的生長點(diǎn)恢復(fù)生長。在武漢種植，進(jìn)入冬季之后，雜種的地上部分與白菜型親本一樣，植株匍匐，生長緩慢，生長點(diǎn)下陷（圖２ｄ），第二年春季氣溫升高后，雜種快速生長，比雙親長勢更為旺盛。

２．４各組合回交一代結(jié)實(shí)情況

為提高各組合雜交后代的育性，在獲得雜種Ｆ１代之后，將雜種與各組合母本甘藍(lán)型油菜進(jìn)行回交，調(diào)查雜種自交和回交結(jié)實(shí)情況。所有組合雜種套袋自交均不結(jié)實(shí)，各組合雜種回交結(jié)實(shí)情況見表２。由表２可以看出，各組合雜種與母本甘藍(lán)型油菜回交每角粒數(shù)均較低，且差異不大。雜交親和性較高的組合在回交中親和性也稍高，其回交親和指數(shù)還是以０６－６３３７為母本的組合最高。

３討論

種間雜交是進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良的一條重要途徑。自上世紀(jì)４０年代，甘白雜交就開始應(yīng)用于油菜育種，各國研究者將白菜型油菜中的優(yōu)良性狀如早熟、抗根腫病、抗黑莖病等成功轉(zhuǎn)移到了甘藍(lán)型油菜中［５-８］，選育出了一批甘藍(lán)型油菜新品種和優(yōu)良育種材料。冬性白菜型油菜具有強(qiáng)抗寒性，目前將白菜型油菜中的抗寒性轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜中的報(bào)道很少。選育強(qiáng)冬性甘藍(lán)型油菜，實(shí)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜的北移以充分利用北方冬閑田是當(dāng)前亟待解決的問題。

此次試驗(yàn)通過雙低甘藍(lán)型油菜與抗寒白菜型油菜種間雜交，初步研究了甘藍(lán)型油菜和抗寒白菜型油菜的雜交親和性。試驗(yàn)結(jié)果表明甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜種間雜交親和性較高，個(gè)別組合親和指數(shù)高達(dá)３．４２，最低的組合也有０．５０。劉忠松［９］通過試驗(yàn)得出甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜雜交親和指數(shù)最高為５．２８，平均親和指數(shù)為０．８９。劉曉霞［１０］以甘白雜交，親和指數(shù)變幅為０．７４～２．５６。二者的結(jié)果與本試驗(yàn)得出的結(jié)果稍有不同，可能是由于雜交親和性受親本基因型和組合方式的影響。同時(shí)劉忠松［９］得出了在親和指數(shù)上也是母本品種間差異大于父本品種間差異，與本研究結(jié)果一致。因此，雖然不同親本間雜交親和力存在一定差異，但通過配制多個(gè)雜交組合也能選出雜交親和力較高的組合做親本，進(jìn)而從一定程度上克服雜交不育的障礙。將各組合雜種與親本甘藍(lán)型油菜回交，各組合回交結(jié)實(shí)性都較差，而且各組合雜種自交未結(jié)實(shí)，這可能是由于以下兩個(gè)原因造成的：①雜種基因組組成為ＡＡＣ，在減數(shù)分裂過程中形成大量的非整倍配子，活力較低，導(dǎo)致無論回交或自交每角粒數(shù)都較低；②白菜型油菜本身是自交不親和的，可能對后代雜種的結(jié)實(shí)性也有影響。

植物抗寒性是多基因控制的數(shù)量性狀，遺傳行為復(fù)雜且易受環(huán)境影響。到目前為止，蕓薹屬植物抗寒性的遺傳研究較少［１１］，有研究者初步定位了白菜型油菜和甘藍(lán)型油菜抗寒相關(guān)性狀的ＱＴＬ［１２，１３］，但目前尚無可直接應(yīng)用于抗寒性輔助選擇的分子標(biāo)記，因此在抗寒甘藍(lán)型油菜選育過程中，抗寒性的鑒定仍要以田間越冬率或電導(dǎo)率、ＳＯＤ活性、可溶性蛋白含量、丙二醛含量等生理生化指標(biāo)為衡量標(biāo)準(zhǔn)［１４，１５］。因本試驗(yàn)中雜種回交結(jié)實(shí)性差，故在２０１１～２０１２年各組合ＢＣ１代在武漢自交繁殖一代，計(jì)劃８月底將ＢＣ１Ｆ２種植在甘肅越冬，進(jìn)行田間抗寒性的鑒定和篩選。

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