Tim3水平對非小細胞肺癌臨床進展及預(yù)后的影響

朱文良，李靖，梁新強，賴林，梁艷艷，陸運鑫，侯恩存

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科二病區(qū)，廣西 南寧 530011；2.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 微創(chuàng)介入科，河南 鄭州 450008；3.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院基礎(chǔ)實驗部，廣西 南寧 530021）

肺癌的發(fā)展與T細胞免疫功能紊亂及T細胞亞群比例失衡有關(guān)[1-2]。T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain 3, Tim3）可與其配體半乳糖凝集素9結(jié)合并抑制輔助性T細胞1（T helper 1 cell, Th1）的活性，下調(diào)Th1免疫應(yīng)答[3]。研究顯示Tim3在多種癌癥患者外周血CD4+和CD8+T細胞中高表達，且與癌癥發(fā)展及預(yù)后相關(guān)[4-6]。提示從外周血中探索Tim3與癌癥預(yù)后的關(guān)系成為一種思路。本研究初步探討非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中Tim3的表達，及其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年9月-2014年9月于廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院醫(yī)院腫瘤內(nèi)科住院的69例NSCLC患者。其中，男性43例，女性26例；年齡27～79歲，平均56.8歲；TNM分期Ⅰ﹑Ⅱ期患者36例（52.2%），Ⅲ﹑Ⅳ期患者33例（47.8%）；鱗癌33例（47.83%），腺癌31例（44.93%），其他5例（7.24%）；腫瘤直徑＜3 cm者45例（65.2%），腫瘤直徑≥3 cm者24例（34.8%）。所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)或影像學(xué)檢測確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合原發(fā)性肺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②無放療和化療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性肺癌患者；②正在使用抗凝劑或抗血小板聚集藥物治療的患者；③伴有自身免疫性疾病。同時選擇本院體檢的65例健康人群（無腫瘤病史，年齡﹑性別匹配）作為對照組。其中，男性41例，女性24例。本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 外周血CD4+T細胞表面Tim3表達水平檢測

清晨空腹條件下采集受試者靜脈血于肝素抗凝管抗凝。Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細 胞（peripheral blood mononuclearcells, PBMC）。 清洗后將PBMC重懸于磷酸鹽緩沖液中。然后于流式管中加入100μl PBMC細胞懸液，并加入藻紅素（Phycoerythrin, PE）-抗人Tim3抗體（1∶1 000稀釋）﹑別藻藍素（Allophycocyanin, APC）-抗人CD3抗體（1∶1 000稀釋）及異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）-抗人CD4抗體（1∶1 000稀釋），4℃避光孵育30min。流式細胞儀進行檢測，每例至少有10 000個細胞用于分析?？贵w均購自美國eBioscience公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，比較用χ2檢驗，Kaplan-Meier法制做生存曲線，比較用Log-rank檢驗；影響因素的分析采用Cox比例風(fēng)險模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者外周血CD4+T細胞表面Tim3表達水平比較

對照組患者外周血CD4+T細胞表面Tim3表達水平[（2.71±1.30）%]與NSCLC組患者外周血CD4+T細胞表面Tim3表達水平[（7.10±2.53）%]比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.231，P=0.000），NSCLC組高于對照組。見圖1。

2.2 NSCLC組患者Tim3高表達與NSCLC臨床病理的相關(guān)性

以NSCLC組患者CD4+T細胞表面Tim3百分比的中位數(shù)（7.16%）為截點分為Tim3高表達組和Tim3低表達組。Tim3高表達與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性（P＜0.05），與年齡﹑性別﹑吸煙史﹑腫瘤直徑及組織類型無相關(guān)性（P＞0.05）。見表1。

2.3 NSCLC組患者Tim3表達水平與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

圖1 兩組患者外周血CD4+T細胞表面Tim3表達水平比較

表1 NSCLC組患者Tim3高表達與NSCLC臨床病理因素的相關(guān)性

Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果表明，NSCLC組患者中位總生存期（overall survival, OS）為13.4個月。其中，Tim3高表達組35例，Tim3低表達組34例。Tim3高表達組和Tim3低表達組中位OS分別為11.7和16.2個月，Log-rank檢驗結(jié)果顯示：Tim3高表達組和Tim3低表達組的OS比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.545，P=0.011），Tim3低表達組患者高于Tim3高表達組患者。見圖2。

圖2 不同Tim3表達水平NSCLC患者生存曲線圖

2.4 NSCLC組患者預(yù)后的Cox風(fēng)險回歸模型單因素及多因素分析

將年齡﹑性別﹑吸煙史﹑腫瘤直徑﹑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移﹑TNM分期及CD4+T細胞表面Tim3表達等因素納入Cox比例風(fēng)險回歸模型進行分析。單因素Cox生存分析結(jié)果表明，男性﹑吸煙﹑腫瘤直徑＜3 cm﹑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0﹑TNM分期Ⅰ﹑Ⅱ期及CD4+T細胞表面Tim3高表達與患者生存不良預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）。進一步多因素Cox比例風(fēng)險模型分析結(jié)果提示Tim3高表達為患者OS的獨立危險因素（P＜0.05）。見表2。

表2 NSCLC組患者預(yù)后的Cox比例風(fēng)險模型單因素及多因素分析

3 討論

肺癌，尤其是NSCLC是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，具有易復(fù)發(fā)﹑易轉(zhuǎn)移的特點。近年來，隨著免疫機制研究的深入，腫瘤免疫治療引起越來越多的重視。美國食品藥品管理局已批準(zhǔn)阻斷名為程序性細胞死亡蛋白1/程序性死亡受體-配體1免疫檢查點的新免疫療法用于晚期肺癌和腎癌的治療。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者外周血CD4+T細胞表面Tim3百分比升高，且與NSCLC生存期相關(guān)，提示Tim3可能是預(yù)測晚期NSCLC預(yù)后的生物指標(biāo)。

T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子家族最早發(fā)現(xiàn)于克隆哮喘小鼠模型中，目前在人體中只發(fā)現(xiàn)3種家族成員（Tim1﹑Tim3及Tim4）[4-6]。Tim廣泛參與Th1和Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，如Tim1可促進細胞因子的產(chǎn)生，Tim4持續(xù)表達于成熟的樹突細胞[7]。研究顯示Tim3與自身免疫疾病及多種癌癥相關(guān)。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血中，CD4+和CD8+T細胞表面Tim3升高并與疾病活動性評分﹑血漿腫瘤壞死因子α表達及疾病惡化程度呈負相關(guān)[8-9]；在卵巢癌﹑膠質(zhì)瘤及骨肉瘤患者外周血CD4+和CD8+T細胞中Tim3高表達，且CD4+T細胞表面Tim3異常高表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。提示外周血Tim3表達水平可以作為癌癥潛在的診斷和預(yù)后指標(biāo)。ZHUANG等[10]對30例NSCLC患者肺癌組織樣本進行免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，Tim3在86.7%的NSCLC患者組織中呈陽性，且與患者預(yù)后有關(guān)。然而，外周血Tim3表達水平是否與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)尚未見報道。同時，由于腫瘤組織的提取過程具有創(chuàng)傷性大，難以獲得等缺點，尋找創(chuàng)傷性小，易操作的預(yù)測指標(biāo)有重要的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者外周血CD4+T細胞表面Tim3水平高于對照組（P＜0.05），且TNM分期Ⅲ﹑Ⅳ期患者血清Tim3高表達水平高于Ⅰ﹑Ⅱ期患者，提示CD4+T細胞表面Tim3的表達增高可能促進NSCLC的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移，其異常表達可能與晚期肺癌局部侵襲有關(guān)。

對69例NSCLC患者Kaplan-Meier生存曲線的結(jié)果顯示，Tim3低表達組中位OS高于Tim3高表達組（P＜0.05），提示Tim3表達量升高與預(yù)后較差有關(guān)。這與Tim3在其他癌癥的作用相同，即在卵巢癌和骨肉瘤患者外周血CD4+T細胞中，Tim3的高水平表達預(yù)示著預(yù)后不良[4﹑6]。Cox比例風(fēng)險模型分析結(jié)果提示Tim3高表達是NSCLC患者OS的獨立危險因素。研究表明Tim3可以通過活化白介素-6（Interleukin-6,IL-6）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3通路抑制CD4+T細胞活化和Th1細胞極化，促進淋巴瘤的發(fā)生[11]。另一方面，Th1細胞可以釋放IL-6等細胞因子。因此，筆者推測一些炎癥通路可能參與了Tim3介導(dǎo)的肺癌的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，CD4+T細胞表面Tim3在NSCLC患者外周血中的高表達與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，可作為評估NSCLC患者預(yù)后的重要指標(biāo)。利用Tim3水平來判定晚期NSCLC患者的生存結(jié)局將為臨床實踐提供了具有新意的指導(dǎo)思路。然而，在外周血CD4+T細胞表面Tim3水平在被納入臨床檢測之前，仍需要大樣本的前瞻性研究進一步評估其應(yīng)用價值。

參 考 文 獻：

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