星點設計-響應曲面法優(yōu)化金釵石斛多糖提取工藝

曾宇馨，賀雨馨，祝天添，張曉敏，孫志蓉 (北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102)

基金項目：貴州赤水石斛產(chǎn)業(yè)科技合作項目(No.赤科合02號)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項資金資助(No.CARS-21)

作者簡介：曾宇馨(1995-)，女，北京中醫(yī)藥大學中藥資源專業(yè)碩士研究生。

通訊作者：孫志蓉*(1967-)，女,博士，教授，博士研究生導師，主要研究方向：中藥質(zhì)量與開發(fā)。

收稿日期：2018-02-15

修回日期：2018-02-25

金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)為蘭科多年生草本植物，其新鮮或干燥莖為金釵石斛藥材，是2015版《中國藥典》收載的石斛藥材來源之一，具有益胃生津、滋陰清熱的功效[1]。金釵石斛的化學成分主要有多糖類、生物堿類、黃酮類、酚類、香豆素類及甾體糖苷類化合物等，其中多糖成分為其主要活性成分[2-6]，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老、抗疲勞等功效[7-12]。近年來,金釵石斛多糖的開發(fā)研究成為熱點，據(jù)食品藥品監(jiān)督管理局統(tǒng)計顯示，已具有準字號的金釵石斛保健品中，超過90%的產(chǎn)品是以多糖為有效成分，所以建立一種穩(wěn)定簡單提取率高的金釵石斛多糖提取工藝極為重要。金釵石斛的常規(guī)提取方法主要為回流法，該方法存在操作繁雜、耗時較長、得率偏低等不足；而近年來研究較多的超聲提取法具有提取效率高、耗時較短、能耗少等優(yōu)勢。在提取工藝優(yōu)化研究方面常采用的正交試驗設計方法雖然較簡便，但未能全面考慮試驗因素之間的交互作用，影響試驗結(jié)果的精確度，預測性較差。而星點設計是響應曲面(Response surface methodology，RSM)中最常用的二階，采用非線性預測模型擬合，具有試驗次數(shù)少，試驗精度高、所得信息量大、直觀等特點[13-14]。故本文在單因素試驗的基礎上，利用星點設計-響應曲面法對金釵石斛多糖提取工藝進行優(yōu)化研究，為金釵石斛資源的高效利用提供依據(jù)。

1 材料

試驗材料于2011年3月采集于貴州赤水市，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥學院中藥資源研究室孫志蓉教授鑒定為蘭科石斛屬植物金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)的干燥莖，憑證標本現(xiàn)存于北京中醫(yī)藥大學中藥資源教研室。水為重蒸水，葡萄糖、濃硫酸、苯酚試劑皆為分析純。

UV-2600分光光度計(上海尤尼科儀器有限公司)；KQ-500E超聲波清洗器(北京鑫科奧科技有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；G-20離心機(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 標準曲線的制備

精確稱取葡萄糖標準品100 mg，用蒸餾水定容于100 ml容量瓶中，吸取上述溶液5 ml用蒸餾水定容于100 ml容量瓶中，溶液濃度為0.05 mg/ml。分別移取上述溶液0.00，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09 ml于15 ml試管中，加蒸餾水至2 ml，再依次加1 ml苯酚，5 ml濃硫酸，搖勻沸水浴20 min，冰浴15 min，在490 nm處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，質(zhì)量濃度C為橫坐標，得到回歸方程為A=24.759C-0.002 6，R2=0.999 2。

2.2 金釵石斛多糖檢測方法的建立

精密稱取已過60目篩的金釵石斛粉末1 g于100 ml具塞三角瓶中，加蒸餾水45 ml，然后于超聲波儀器內(nèi)進行提取(功率：150 W，溫度：60 ℃)，2 h后對提取液進行離心(5 000 r/min，20 min)，取上清液進行抽濾，得濾液定容至45 ml容至瓶后取1 ml定容至100 ml容量瓶中，再取2 ml上述溶液于15 ml試管中，按2.1的方法進行測定吸光度A。

2.3 金釵石斛多糖提取工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗

2.3.1.1 料液比對多糖得率影響

確定超聲溫度60℃，時間2 h，功率250 W，料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，分別超聲提取2次，測多糖得率。隨著料液比增大，多糖得率逐漸增大，但在1∶60之后，升高較緩；出于節(jié)約藥材成本考慮，單因素最佳料液比結(jié)果為1∶40,結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對多糖得率影響

2.3.1.2 溫度對多糖得率影響

確定料液比1∶60，時間2 h，超聲功率250 W，溫度40℃，50℃，60℃，70℃，80℃,分別超聲提取2次，測定多糖得率。由圖2可以看出，隨著溫度不斷升高，多糖得率也呈上升趨勢，于70℃前一直處于升高趨勢，70～80℃之間上升非常緩慢，因此單因素最佳溫度結(jié)果為70℃，結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對多糖得率的影響

2.3.1.3 時間對多糖得率影響

確定料液比1∶60，溫度60℃，超聲功率250 W，時間30 min，60 min，90 min，120 min，150 min，180 min,分別超聲提取2次，測定多糖得率。在90 min之前，多糖得率隨時間的延長快速升高，而90 min之后，多糖得率升高比較緩慢，因此單因素最佳時間結(jié)果為90 min，結(jié)果見圖3。

圖3 時間對多糖得率的影響

2.3.1.4 超聲功率對多糖得率影響

確定料液比1∶60，溫度60℃，時間60 min，超聲功率200 W，250 W，300 W，350 W，分別超聲提取2次，測定多糖得率。隨著超聲功率的增加，金釵石斛得率逐漸降低，因此金釵石斛單因素最佳超聲功率結(jié)果為200 W，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲功率對多糖得率的影響

2.3.1.5 提取次數(shù)對多糖得率影響

確定料液比1∶60，溫度60℃，時間60 min，超聲功率250 W，分別超聲提取1次，2次和3次，測定多糖得率。由圖5可知，提取次數(shù)由1次增加到2次，多糖得率的增加比較明顯，而由2次增加到3次，多糖得率幾乎無變化，從經(jīng)濟成本角度考慮，金釵石斛單因素最佳提取次數(shù)結(jié)果為2次，結(jié)果見圖5。

圖5 提取次數(shù)對多糖得率的影響

2.3.2 試驗設計與結(jié)果

根據(jù)星點試驗設計的原理，再綜合單因素試驗的結(jié)果，選出料液比，超聲溫度與超聲時間對金釵石斛多糖得率影響最為顯著的3個因素，每因素設置5水平，分別用代碼-α，-1，0，+1，+α來表示，每一代碼值所代表的物理量見表1，星點試驗設計與結(jié)果見表2。

按Central composite試驗設計中統(tǒng)計學要求，對20組試驗進行回歸擬合，詳細結(jié)果見表3。

表1 星點設計因素水平表

表2 星點設計試驗結(jié)果

表3 試驗結(jié)果方差分析表

注：*表示與模型組由顯著性差異；**表示與模型組有極顯著性差異

利用Design-Expert8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行響應面分析，以多糖得率(Y)為響應值分別對各因素(X1，X2，X3)進行多元線性回歸和二項式方程擬合，擬合模型如下：

多元線性回歸方程：Y=5.79+0.74X1+0.21X2+0.59X3(R2=0.837 0<0.9)

二項式擬合模型：Y=6.18+0.74X1+0.21X2+0.59X3-0.070X1X2+0.25X1X3+0.14X2X3-0.18X12-0.13X22-0.24X32(R2=0.973 6>0.9)

上述的多元線性擬合模型：P值小于0.05，說明模型有差異，但由于R2值小于0.9，說明模型的相關性較差，不符合要求，故舍去；得到上述擬合的二項式方程相關系數(shù)較高，擬合效果好。由二項式擬合模型可知，多糖得率模型的P值小于0.05，具有顯著性差異。且模型失擬項(Lack of Fit)大于0.05，表示模型預測值與實際值差異不顯著，模型選擇合理，模型可靠。

回歸方程中各因素系數(shù)值可直接反映出各試驗因子對指標值的影響程度，F(xiàn)值越大，表示該試驗因素越重要。由表3可知，超聲法提取金釵石斛多糖的因素顯著性順序為：料液比>超聲提取時間>超聲提取溫度。通過分析得到超聲法提取金釵石斛多糖的最佳條件組合為：料液比1∶45，時間72 min，溫度65℃，功率200 W提取2次,此時多糖得率為7.48%。兩因素交互作用響應曲面見圖6～8。

圖6 料液比和溫度交互影響金釵石斛多糖得率的等高線及曲面圖

圖7 料液比和時間交互影響金釵石斛多糖得率的等高線及曲面圖

圖8 時間和溫度交互影響金釵石斛多糖得率的等高線及曲面圖

2.3.3 金釵石斛多糖超聲提取工藝驗證試驗

平行精密稱取1 g過60目篩的金釵石斛粉3份，分別按照供試品的制備方法于最佳工藝條件下操作，按“2.2”項下操作，測定金釵石斛多糖的提取率，通過表4可以表明，在最佳工藝條件下測得的金釵石斛多糖提取率高而穩(wěn)定。

表4 驗證試驗結(jié)果表

3 討論

鄧維澤[15]、余芳[16]等運用單因素試驗和正交試驗設計對金釵石斛多糖提取工藝進行了研究，最終多糖得率分別為3.11%和6.945%。本試驗在考察單因素的基礎之上，利用三因素五水平星點設計-響應面法對金釵石斛多糖的提取工藝進行優(yōu)化，預測出最佳提取工藝條件為料液比1∶45，超聲提取溫度65℃，超聲提取時間72 min，共提取2次；二項式擬合判定系數(shù)較高(R2=0.960 6)。根據(jù)預測工藝得出金釵石斛多糖實際得率為7.57%，與預測值偏差0.8%。

已有研究[17]和本試驗結(jié)果均表明，料液比為石斛多糖提取工藝中的主要影響因素。本文的料液比為1:45，比以往研究用量稍有增加；其次，本文的提取功率為200 W，為本試驗所用超聲波儀器的最小功率，超聲功率單因素試驗表明，200 W時提取得率為優(yōu)，從經(jīng)濟角度考慮能節(jié)省成本，且效果較好；溫度與以往研究相對一致，在單因素圖中能發(fā)現(xiàn)60℃～70℃時，得率有明顯變化，遂選擇65 ℃提取條件較較好；再其次，提取次數(shù)有所增加，一定程度上使多糖得率更優(yōu)；最后，本文使用單因素試驗及星點設計-響應曲面法分析，在前人研究的基礎上，分析結(jié)果得出的提取工藝更為準確。

本文采用的星點設計-效應曲面法應用非線性模型，較好地解決了傳統(tǒng)正交優(yōu)化與均勻設計優(yōu)化的不足，并能明顯減少試驗總次數(shù)；將交互作用闡述明了，精度較正交設計而言也相對高，擬合預測能力準確可靠。將該方法用于中藥有效成分的提取分離領域，有良好的應用前景。然而，優(yōu)化星點設計-效應曲面法的前提是設計的試驗點應該包括最佳試驗條件，若試驗點選擇不當，則不能得出較好的優(yōu)化結(jié)果。因此，在使用星點設計-效應曲面法之前，應該確定合理的因素水平范圍。本文的得的優(yōu)化工藝條件為金釵石斛多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了科學依據(jù)，便于金釵石斛的綜合利用開發(fā)。

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