截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭模型大鼠肝細胞增殖途徑的影響

郝玉林，楊文龍，侯偉欣，田甜，張秋云，高連印，杜宇瓊

(首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，中醫(yī)絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069)

慢加急性肝衰竭是在慢性肝病基礎上發(fā)生的急性肝功能失代償[1]，具有病情重、進展迅速、并發(fā)癥多等特點。目前臨床上主要采用抗病毒、人工肝支持療法、肝移植等治療手段，但治療效果并不理想[2]。肝細胞的異常凋亡是肝衰竭的重要發(fā)病機制，而肝衰竭的發(fā)生與肝細胞增殖障礙也有密切關系。截斷逆挽方是錢英教授治療慢加急性肝衰竭的一個有效經驗方，課題組前期臨床研究結果證實了其有效性[3]。前期課題組實驗結果提示,“截斷逆挽方”對ACLF模型大鼠肝功能、肝組織都有一定的保護作用，并能減輕肝組織炎性損傷和肝細胞凋亡[4-10]。本實驗旨在通過觀察截斷逆挽方對ACLF大鼠肝細胞增殖過程中關鍵基因CyclinD1、CyclinA、CDK4及關鍵蛋白DP1表達量的影響，進一步驗證該方通過調節(jié)肝細胞增殖預防性干預ACLF大鼠的作用機制，繼續(xù)為臨床應用該方提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

Wistar雄性大鼠150只，SPF級，體質量180～200 g，于北京維通利華實驗動物技術有限公司采購，合格證號：SCXK(京)2012-0001。首都醫(yī)科大學動物房飼養(yǎng)，實驗室合格證號：SYXK(京)2005-0022。每籠3只，自由飲食，室溫18～23℃，濕度(50.0±2.0)%，每隔12 h開燈照明。

1.2 主要試劑

人血清白蛋白(HSA)(Sigma，A9731-5G)；D-氨基半乳糖(D-GalN)(Sigma，G0500-25G)；脂多糖(LPS)(Sigma，109K4075)；Anti-DP1(Santa);RNA Prep Pure 動物組織總RNA提取試劑盒(離心柱型)(DP431)，TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒(KP104)，Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒(FP204)，2×Taq PCR Master Mix(KT201-01)，50bpDNA Ladder(MD108)，MarkⅢ(MD103)，Gene Green 核酸染料(RT210)均購自天根生化科技有限公司。

1.3 藥物

截斷逆挽方(苦味葉下珠30 g、瓜蔞30 g、金錢草30 g、生黃芪30 g、槲寄生30 g、三七6 g、莪術6 g、丹參20 g、生地黃20 g、黑附片15 g)，藥材購自北京同仁堂中醫(yī)醫(yī)院中藥房，濃煎成4.34 g/ml，4℃保存，使用前水浴加熱。

1.4 主要儀器

1-14高速離心機(Sigma)；Universal 320R低溫離心機(Hettich)； F6/10超細勻漿器(Fluko)；EG720EAU-SS微波爐(美的)；Model680酶標儀(Bio-Rad)；165-8003s水平電泳儀(Bio-Rad)；170-3930濕轉電轉儀(Bio-Rad)；Odysseey2.1紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(LI-COR)。

2 實驗方法

2.1 ACLF大鼠模型的建立

參照劉旭華[11]造模方法，ACLF大鼠模型建立方法分為兩個階段。1)肝硬化模型階段：Wistar雄性大鼠150只，隨機分為正常對照組10只和處理組140只，處理組皮下注射人血清白蛋白致敏，檢測人血白蛋白抗體是否陽性，取陽性大鼠繼續(xù)尾靜脈注射人血清白蛋白，每次0.5 ml/只，正常組大鼠注射等量生理鹽水，6周后對全部大鼠行肝活檢，按肝纖維化6級法判斷肝硬化程度。取肝纖維化三級以上大鼠繼續(xù)尾靜脈注射2周，造模成功98只，將98只成模大鼠隨機(采用random函數生成隨機序號)分為模型組、中藥組各49只。2)慢加急肝衰竭模型階段：模型組、中藥組同時給予D-GalN 400 mg/kg聯合LPS 100 μg/kg腹腔注射進行急性攻擊，建立ACLF模型。

2.2 分組與給藥方法

急性攻擊前，中藥組根據課題組前期實驗得出的有效劑量[4]給予生藥量為21.7 g/(kg·d)的截斷逆挽方，濃度為4.34 g/mL連續(xù)灌胃3天，正常組及模型組給予同等劑量生理鹽水灌胃。各組大鼠分別于急性攻擊4 h、8 h、12 h后進行平行取材，每組每個時間點14只。另外模型、中藥各設24 h生存組各7只。大鼠麻醉后腹主動脈取血，摘取肝右葉同一部分置于10%福爾馬林溶液固定，余下部分于液氮中快速凍存。

2.3 Western Blot法檢測肝組織中DP1蛋白的表達量

于-80℃冰箱取出凍存肝組織，每組每個時間點取6只進行勻漿、蛋白定量，按照蛋白定量試劑盒說明書步驟測定蛋白濃度。每支上樣蛋白84 μg，經10% SDS-聚丙烯凝膠電泳分離后300 mA電轉1 h至0.22 μm NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，DP1抗體(1∶100)4℃孵育過夜，TBST洗滌，加二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。暗室曝光，將膠片進行掃描，以β-actin作為參照蛋白，用Quantity One圖像分析軟件分析目標條帶的光密度值，通過灰度比較的方法來確定目的蛋白相對于內參的表達量，以分析樣本之間目的蛋白表達量差異。

2.4 實時熒光定量法檢測CyclinD1、CDK4、CyclinA mRNA的表達量

根據RNA Pre Pure 動物組織總RNA提取試劑盒的說明提取總RNA。用Model680酶標儀檢測總RNA的濃度和純度，取A260/A280在1.8～2.2的RNA樣品做下一步實驗，利用2%瓊脂糖凝膠檢測其完整性。根據TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄。引物采用TaKaRa公司設計并合成，引物序列見表1；擴增反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性30 sec，54℃退火10 sec，72℃延伸10 sec，共循環(huán)40次，4℃保存。以基因β-actin為內參對照，用2-△△Ct(Ct代表循環(huán)閾值)表示CyclinD1、CDK4、CyclinA mRNA相對表達量。

表1 引物序列

2.5 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 24 h生存率觀察

觀察模型組、截斷逆挽方組急性攻擊后24 h組存活率發(fā)現，模型組急性攻擊后24 h內7只存活2只，存活率為28%。截斷逆挽方組7只存活4只，存活率為57%，模型組低于截斷逆挽方組，但差異無統(tǒng)計學意義。截斷逆挽方存活時間長于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見表2。

表2 各組大鼠生存時間比較

注：與模型組比較，*P<0.05

3.2 截斷逆挽方對ACLF大鼠肝組織DP1蛋白表達的影響

如表3所示，與正常組相比，模型4 h組DP1蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并呈逐漸降低趨勢，至12 h表達最少，但仍較正常組略高，差異無統(tǒng)計學意義。與4 h、8 h模型組相比，截斷逆挽方組蛋白表達有升高趨勢，差異無統(tǒng)計學意義;而至12 h末表達量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果見圖1～2。

表3 各組大鼠DP1表達IOD值比較

注：與同一時間點模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖1 各組大鼠肝組織DP1蛋白表達量比較 注：與同一時間點模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖2 各組大鼠肝組織DP1蛋白表達免疫印跡電泳圖 注：A：截斷逆挽方4 h組；B：截斷逆挽方 8 h組；C：截斷逆挽方12 h組；D：正常組；E：模型4 h組；F：模型8 h組；G：模型12 h組

3.3 截斷逆挽方對ACLF大鼠肝組織CyclinD1 mRNA表達的影響

如表4所示，與正常組相比，模型4 h CyclinD1 mRNA表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，模型8 h、12 h表達量雖高于正常組，但相對于4 h逐漸降低。與模型組相比，截斷逆挽方組4 h CyclinD1 mRNA表達量差異不大，8 h較模型組升高，12 h時截斷逆挽方組表達量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。截斷逆挽方組CyclinD1 mRNA表達量在8 h降低，在12 h明顯增高。結果見圖3。

表4 各組大鼠CyclinD1 mRNA表達量的比較

注：與同一時間點模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖3 各組大鼠肝組織中Cyclin D1表達量比較注：與同一時間點模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.4 截斷逆挽方對ACLF大鼠肝組織CDK4 mRNA表達的影響

如表5所示，與正常組相比，模型組4 h、8 h CDK4 mRNA表達量升高，12 h時有所降低，差異無統(tǒng)計學意義。且模型組隨著時間的推移，表達量逐漸降低。與模型組相比，截斷逆挽方組4 h、8 h CDK4 mRNA 表達量有所升高，差異無統(tǒng)計學意義。12 h時截斷逆挽方組CDK4 mRNA表達量明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結果見圖4。

表5 各組大鼠CDK4 mRNA表達量的比較

注：與同一時間點模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖4 各組大鼠肝組織中CDK4 mRNA表達量比較注：與同一時間點模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.5 截斷逆挽方對ACLF大鼠肝組織CyclinA mRNA表達的影響

如表6所示，與正常組相比，模型4 h CyclinA mRNA表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，模型8 h、12 h表達量雖高于正常組，但相對于4 h逐漸降低。與模型組相比，截斷逆挽方組4 h CyclinA mRNA表達量差異不大，8 h較模型組升高，12 h時截斷逆挽方組表達量明顯高于模型組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。截斷逆挽方組CyclinA mRNA表達量在8 h降低，在12 h明顯增高。見圖5。

表6 各組大鼠CyclinA mRNA表達量的比較

注：與同一時間點模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖5 各組大鼠肝組織中CyclinA mRNA表達量比較注：與同一時間點模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01

4 討論

ACLF的發(fā)生是在多種因素作用下，引起大量肝細胞過度死亡的結果。其發(fā)生機制，除肝細胞死亡外，肝細胞的異常凋亡在肝衰竭過程中起著重要作用，而肝細胞的凋亡又可誘導肝細胞的代償性增殖[12-13]，如果肝細胞過度凋亡，而肝細胞代償性增殖又障礙，則必然導致肝衰竭。

正常情況下，肝細胞為暫不增殖細胞群，即G0期，在肝細胞大量凋亡的刺激作用下，肝細胞可迅速重新進入細胞周期，產生增殖再生。E2F1調控細胞周期的作用,主要受視網膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,pRB)的調控，E2F1與pRb一起參與調控細胞由G0/G1期向S期的過度。CyclinD1、CDK4、CyclinA和DP1是E2F1介導的細胞增殖途徑的關鍵蛋白，CyclinD1與細胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)CDK4/6結合, CDK4/6被激活, CDK4/6-Cyclin D復合物與其底物pRb作用，pRb被磷酸化，破壞E2F1-DP1-pRb復合物，使DP1被釋放出來，正反調節(jié)某些基因的轉錄，產生細胞進入S期的必需的蛋白產物，如Cyclin A、Cyclin E、Cdc25等[14]。在本試驗中，模型4 h組的肝組織中CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1的表達量均顯著高于正常組，推測這是由于肝細胞大量凋亡，刺激肝細胞增殖相關通路，上調了CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1的表達量。隨著時間的推移，模型組CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1表達量逐漸降低?？梢?，隨著時間的推移模型組的肝細胞增殖活動呈下降趨勢，實驗前期結果顯示，隨著時間推移，大鼠肝細胞凋亡逐漸增多，直至肝細胞大面積凋亡、壞死[5-10]，此時細胞增殖不足于代償肝細胞過度凋亡、死亡，必然導致肝衰竭。進一步對模型組和截斷逆挽方組進行分析比較，結果顯示,截斷逆挽方4 h組CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1表達量與模型組比較無明顯差異，8 h組CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1表達量與模型組比較有升高趨勢，12 h 組CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1表達量較模型組明顯升高(P<0.01)，說明截斷逆挽方預防干預，可以通過調節(jié)E2F1信號通路CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1表達量，促進肝細胞的代償性增殖，其作用在攻擊后4 h尚不明顯，8 h已有體現，至12 h已有明顯體現；既往研究結果提示,截斷逆挽方8 h組和12 h組肝細胞凋亡明顯減弱[5-10]。如此，增殖提升，凋亡減弱，肝功能得到較好的代償，則可以改善肝衰竭，避免最終走向死亡的不良結局。如果后續(xù)繼續(xù)給與截斷逆挽方治療，推測其在提高肝細胞增殖，減少凋亡，抑制肝衰竭方面能取得更好的療效。

截斷逆挽方是國家名老中醫(yī)錢英教授臨床治療慢性重型肝炎的經驗方，其主要功效為解毒化瘀，扶助正氣。慢加急性肝衰竭的主要病因為濕熱疫毒損傷肝絡，阻遏氣機，氣機受阻，則血行不暢，久而化瘀，瘀久化熱，進而暗耗營血，血傷則氣亦傷，從而形成毒瘀膠著，正氣虧虛的病機，與截斷逆挽方病機相符，其中苦味葉下珠、瓜蔞、金錢草、莪術、丹參清熱解毒化瘀，祛除實邪，減少對正氣的損害；生黃芪、槲寄生、三七、生地黃、黑附片扶助正氣，祛邪與扶正共同作用增強，使細胞增殖活動加強，達到減緩肝衰竭進程的目的。

綜上所述，截斷逆挽方可有效的延長大鼠存活時間，并能通過調節(jié)E2F1肝細胞增殖信號通路CyclinD1、CDK4、CyclinA及DP1表達量，促進了肝細胞的代償性增殖，從而改善肝細胞的大面積壞死，抑制肝衰竭。

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