牙鲆抗遲緩愛德華氏菌病家系的繼代選育與早期速生家系篩選*

李澤宇 陳松林 郭 華 王 磊 王 倩 李仰真楊英明 劉壽堂 孫德強 李文升 王曉梅

(1. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；3. 山東海陽市黃海水產(chǎn)有限公司 煙臺 265100；4. 山東萊州明波水產(chǎn)有限公司 煙臺 261418)

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我國北方沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖魚類之一。近年來，牙鲆的大規(guī)模工廠化養(yǎng)殖發(fā)展迅速，高密度的工廠化養(yǎng)殖和長期的近親交配導(dǎo)致牙鲆種質(zhì)退化、病害頻發(fā)、產(chǎn)量下降，嚴(yán)重妨礙了牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展(王志敏等, 2005;司飛等, 2017)。

遲緩愛德華氏菌病是由遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)引起的水生動物疾病(陳愛平等,2011)，俗稱腹水病。該病具有感染率高、感染后死亡迅速、患病前期不易被發(fā)現(xiàn)等特點，25℃~30℃水溫時該病最易發(fā)生。遲緩愛德華氏菌主要通過魚類消化道、表皮受傷破損處、鰓進入魚體，也可通過接觸患病魚體、攝入攜帶遲緩愛德華氏菌的食物或生物餌料而相互感染(陳愛平等, 2011)。李寧求等(2012)對愛德華氏菌菌蛻制備條件進行了優(yōu)化，為鰻源遲緩愛德華氏菌病疫苗開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。陳昌福等(1998)對從日本鰻鱺(Anguilla japonica)分離出的遲緩愛德華氏菌進行致病力測試，注射菌液后的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病的日本鰻鱺癥狀相同。

陳松林等(2008)、徐田軍等(2010)、王磊等(2013)分別于2007、2009及2012年建立了大量牙鲆家系，通過鰻弧菌(Vibrio anguillarum)感染實驗，已經(jīng)選育出牙鲆抗鰻弧菌家系。陳松林等(2011)自2003年起，對中國牙鲆進行人工感染鰻弧菌，選育出中國本地的抗病群體，然后將中國本地的抗病群體與日本引進的牙鲆群體雜交，獲得養(yǎng)殖成活率高、生長較快的群體，將其作為母本，以韓國引進牙鲆的選育群體作為父本進行雜交得到的三雜交后代，育成了牙鲆“鲆優(yōu)1號”新品種。張英平等(2014)、孫何軍等(2015)和鄭衛(wèi)衛(wèi)等(2016)分別利用遲緩愛德華氏菌對牙鲆家系進行攻毒感染，篩選出了一些抗遲緩愛德華氏菌家系，為培育抗遲緩愛德華氏菌牙鲆新品種奠定基礎(chǔ)。齊文山等(2014)研究表明，冷凍保存的異源精子可以誘導(dǎo)建立牙鲆卵裂雌核純系，有助于構(gòu)建牙鲆優(yōu)良純系。侯吉倫等(2014)以牙鲆兩代雌核發(fā)育的個體為親本，再度誘導(dǎo)雌核發(fā)育，獲得三代雌核發(fā)育后代，結(jié)果顯示，雌核發(fā)育后代個體的純合度、平均遺傳相似度進一步提高。

本研究主要通過家系選育方法，以2007、2009、2014年選育出的抗病牙鲆家系為親本，于2016年培育出28個牙鲆家系，從中篩選出抗病速生牙鲆家系，并對這些家系進行了抗遲緩愛德華氏菌感染能力測試和比較分析。

1 材料與方法

1.1 牙鲆家系的建立

親魚來源包括：日本牙鲆，韓國牙鲆，2009、2010、2012、2013及 2014年牙鲆家系。2016年 4月開始進行2016年抗遲緩愛德華氏菌牙鲆家系的培育。本次家系建立共使用雌魚25尾，來自于16個不同家系；雄魚27尾，來自于10個不同家系。家系命名規(guī)則參照王磊等(2013)，即F(family)+家系建立年份+家系編號。

1.2 魚苗早期生長性能測定

2016年7月15日~9月15日，在山東萊州明波水產(chǎn)有限公司進行牙鲆家系生長性能測定實驗，測定方法參照田永勝等(2009)。2016年7月15日，將魚苗(69~90日齡)分別飼養(yǎng)在水體積為2.5 m3的圓形玻璃鋼養(yǎng)殖桶中，每組300尾。實驗期間，對魚苗進行飽食投喂，流水養(yǎng)殖，保持水溫 22℃，24 h光照。60 d后，從所有牙鲆家系中各隨機選取50尾魚苗進行生長測量。測量指標(biāo)主要為全長(從吻端到尾鰭末端)和體重。

1.3 抗病性能測定

通過預(yù)實驗確定半致死濃度，再從每個家系中選取100尾牙鲆魚苗(169~186日齡)，采用腹腔注射半致死濃度的菌液，注射劑量與預(yù)實驗相同，并用PBS注射作對照組。攻毒感染實驗的水溫為(22±1)℃，注射后，每隔6 h檢查并取樣，及時清理死魚，記錄每條魚的死亡時間、家系號，測量死魚的全長、體重。感染后12 d，統(tǒng)計每個家系的存活魚苗數(shù)量，測量其全長和體重。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用 SPSS 19.0軟件計算各家系的平均全長和體重，統(tǒng)計死亡與存活魚苗數(shù)量，計算各個家系的存活率及各表型的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 牙鲆家系的建立

本研究于2016年成功建立和培育了28個牙鲆家系，包括F3代家系4個、F4代家系23個和對照家系1個(表1)。對照家系來自山東海陽黃海水產(chǎn)有限公司同時期繁育的普通牙鲆魚苗。親魚培育、苗種繁育參照陳松林等(2008)。

2.2 28個牙鲆家系的魚苗早期階段生長性能分析

由于前期魚苗較小，難以測量單個魚苗的體重，故只進行了魚苗體長測定。生長性能測定時間為60 d，測定時魚苗較小，故篩選的速生家系屬于早期生長快速的家系，對速生家系的篩選具有參考意義(表 2)。將全長日增長率大于 0.160 cm/d的家系定為早期快速生長家系，共5個(F1639、F1621、F1661、F1606、

F1648)，其平均全長日增長率為0.168 cm/d，占所有家系的17.9%；將全長日增長率在0.150~0.160 cm/d之間的家系定為早期生長速度一般家系，共9個，平均全長日增長率為0.152 cm/d，占所有家系的32.1%；將全長日增長率小于0.150 cm/d的14個家系定為早期慢速生長家系，平均全長日增長率為0.142 cm/d，占所有家系的50.0%(圖1)。

表1 28個牙鲆家系親本信息Tab.1 Parental information of 28 flounder families

表2 28個牙鲆家系的全長日增長率Tab.2 Daily length gain rate of 28 flounder families

2.3 28個牙鲆家系的抗病性能差異

圖1 28個牙鲆家系的全長日增長率Fig.1 Daily length gain rate of 28 flounder families

觀察結(jié)果顯示，注射24~72 h后，所有家系魚攝食量減少，活力下降，出現(xiàn)白色糞便，部分魚表現(xiàn)腹水癥狀。第3天開始出現(xiàn)死亡，死亡的個體體色發(fā)黑，腹部腫脹，部分個體有腸道外露現(xiàn)象。第 4、5天開始大規(guī)模死亡，死亡持續(xù)到第12天逐漸穩(wěn)定，總體平均存活率為(44.48±19.72)%(表 3)。其中，F(xiàn)1639、F1601、F1633、F1635、F1657、F1606和 F1631 7個家系(占總量的25.0%)的存活率均高于60%，定義為高抗病力家系；11個存活率介于30%~60%之間的家系(占比39.3%)，定義為抗病力一般的家系；10個存活率低于30%的家系(占總量的35.7%)，稱為低抗病力的家系(圖2)。

2.4 28個家系生長與抗病性能相關(guān)性分析

使用SPSS 19.0軟件對28個牙鲆家系中生長性能與抗病性能進行皮爾森相關(guān)性分析(表 4)，P<0.05說明存活率與生長性狀顯著相關(guān)，其中，全長與存活率的相關(guān)系數(shù)為 0.496，全長日增長率與存活率的相關(guān)系數(shù)為0.301，體重與存活率的相關(guān)系數(shù)為0.432，說明存活率與全長、全長日增長率、體重之間呈現(xiàn)中等相關(guān)性。

2.5 抗病速生家系篩選及其來源

由圖1和圖2可見，F(xiàn)1639家系早期生長最快，抗病力也最強，為F4代中的速生高抗病力家系。F1639的母本來自F1421家系，父本來自F1430家系。F1430家系為 F3代中篩選出的生長快速家系，其母本來自F0917家系，父本來自F0915家系，均為抗病速生家系；F1421家系為F3代選育出的抗病速生家系，其母本來自F0927家系，父本來自F0915家系。F0927家系為 F2代篩選出的抗病力高家系，是 F0750家系個體雌核發(fā)育后代。F0750為F1代選育出的抗病力高家系，親本為選育出的中國牙鲆抗病選育群體(RS)與日本引進后選育的牙鲆群體(JS)。

F1639家系的感染存活率為77.23%，比2016年構(gòu)建的28個家系的平均存活率(44.48%)高32.75%。F1421家系為F3代選育出的抗病力高家系，存活率為47.06%，比F3代平均存活率(20.29%)高26.77%。F0927家系為 F2代篩選出的抗病力高家系，感染存活率為64.97%，比F2代平均存活率(28.24%)高36.73%。F0750為 F1代選育出的抗病力高家系，感染存活率為64.05%，比F1代平均存活率(32.60%)高31.45%。

圖2 感染后各牙鲆家系存活率統(tǒng)計Fig.2 Statistic of survival rate of the infected flounder family

表4 牙鲆28個家系中各項表型間相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis of phenotypes in 28 flounder families

圖3 抗病家系系譜Fig.3 The family trees of disease resistance family虛線外框家系為抗病家系，箭頭上端為親本，←為雜交，KS：韓國群體；RS：抗病群體；JS：日本群體；LS：鱸魚精子The families in frame with dotted lines are the resistant families, the upper ends of the arrows are the parents of families arrowed, ←represent hybridization,KS: Korean stocks; RS: Disease-resistant stocks; JS: Japanese stocks; LS: Lateolabrax japonicus sperm

3 討論

牙鲆等多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物感染遲緩愛德華氏菌后會出現(xiàn)攝食量和活力明顯下降，腹腔膨大，腹膜軟化出血，內(nèi)臟腫大甚至外漏，肝、腎等組織局灶性壞死等臨床癥狀(張曉君等, 2005; 劉云等, 2000)，這些癥狀與本研究所觀察到的結(jié)果基本一致。另外，比較人工腹腔注射感染與自然感染，人工注射感染的發(fā)病癥狀表現(xiàn)突出，發(fā)病情況較為普遍，不同家系之間的抗病力差異區(qū)分明顯。

2016年本研究共建立了28個牙鲆家系，包括F3代家系4個、F4代家系23個和對照家系1個。通過遲緩愛德華氏菌攻毒感染實驗，成功篩選出抗遲緩愛德華氏菌 F3家系 2個(F1601和 F1606)，F(xiàn)4代家系5個(F1633、F1635、F1639、F1657和 F631)。分析表明，2016年抗病力強的家系的父本來自2014年抗遲緩愛德華氏菌病家系(F1406、F1421和F1422)，其祖先或祖先之一67%來自抗鰻弧菌家系。由此可見，近年來本實驗室不斷選育的牙鲆抗病家系效果明顯。在抗病力強的7個家系中，F(xiàn)1639家系的早期階段的全長日增長率(0.174 cm/d)最高，為早期快速生長家系；F1606為早期快速生長家系，F(xiàn)1633和F1635為生長速度一般家系。綜合比較這些家系的抗病和生長性能可以看出，F(xiàn)1639在抗病和生長性能方面都優(yōu)于其他家系，可作為以后研究的F4代重點家系。馬愛軍等(2014)從2010年開始大菱鲆抗鰻弧菌病選育研究，成功選育出5個抗病力較強的優(yōu)良家系，可作為抗鰻弧菌選育的核心育種群體。朱佳杰等(2012)構(gòu)建了吉富羅非魚(GIFT strain Oreochromis niloticus)家系，并進行無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)攻毒感染實驗，利用家系選育方法對吉富羅非魚進行了抗病品種選育的研究。

為了說明抗病選育對各世代抗病力的提高情況，比較本實驗室所培育的牙鲆F1~F4世代家系攻毒感染后的存活率。其中，F(xiàn)1代為 2007年陳松林等(2008)建立的抗鰻弧菌病家系，F(xiàn)2代家系為2009年王磊等(2013)建立的抗鰻弧菌病家系，F(xiàn)3代家系為 2014年孫何軍等(2015)建立的抗遲緩愛德華氏菌病家系。本實驗建立的大多數(shù)為F4代抗遲緩愛德華氏菌病家系。

F1代與 F2代進行的是抗鰻弧菌選育，F(xiàn)2代家系對鰻弧菌攻擊的抗病力顯著增強，抗病力高家系的攻毒感染存活率由 F1代的 51.86%提高至 F2代的60.68%。F3代與 F4代進行的是抗遲緩愛德華氏菌選育，抗病力高家系的攻毒感染存活率由F3代的40.59%提高至F4代的72.14%。在家系選育中，雖然家系培育占用場地較多、牙鲆親魚性成熟時間較長，但家系選育能夠增加有效群體數(shù)量，控制近交系數(shù)的增量，延長世代間隔，減少基因流失(黃永春等, 2013)，因此，家系選育是進行魚類抗病良種培育的重要技術(shù)手段。

經(jīng)過 F1代、F2代選育出的牙鲆家系具有生長迅速、養(yǎng)殖成活率較高、抗鰻弧菌感染的優(yōu)點。本研究通過家系選育，建立了牙鲆抗遲緩愛德華氏菌病家系，成功篩選到抗病力強、生長快速的 F4代家系(F1639)，為進一步培育抗病高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的牙鲆優(yōu)良品種奠定了重要基礎(chǔ)。本研究表明，經(jīng)過多代的家系選育和攻毒感染實驗，牙鲆的抗病力得到逐代提升，實現(xiàn)了抗病力性狀向后代的穩(wěn)定遺傳。本研究結(jié)果對于其他魚類抗病良種培育，具有重大的應(yīng)用價值和廣闊的推廣前景。

Chen AP, Jiang YL, Qian D, et al. Edwardsiellasis. China Fisheries, 2011(7): 49–50 [陳愛平, 江育林, 錢冬, 等. 遲緩愛德華氏菌病. 中國水產(chǎn), 2011(7): 49–50]

Chen CF, Wu ZX, Gao HJ. Isolation and identification of pathogenic bacteria causing Edwardsiellosis in eel (Anguilla japonica). Journal of Huazhong Agricultural University,1998, 17(4): 382–388 [陳昌福, 吳志新, 高漢嬌. 日本鰻鱺愛德華氏菌病病原菌的分離與鑒定. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1998, 17(4): 382–388]

Chen SL, Tian YS, Xu TJ, et al. Development and characterization for growth rate and disease resistance of disease-resistance population and family in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus). Journal of Fisheries of China, 2008, 32(5):665–673 [陳松林, 田永勝, 徐田軍, 等. 牙鲆抗病群體和家系的建立及其生長和抗病性能初步測定. 水產(chǎn)學(xué)報,2008, 32(5): 665–673]

Chen SL, Tian YS. 2011 Japanese flounder “Pingyou No.1”. In:National Fisheries Technology Extension Station. 2010 new aquatic breeds promotion guide. Beijing: Agricultural Press China, 2011 [陳松林, 田永勝. 2011牙鲆“鲆優(yōu)1號”. 全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站. 2010水產(chǎn)新品種推廣指南. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2011]

Hou JL, Li C, Wang GX, et al. Analysis of genetic structure of three third-generation of successive meiogynogenetic families in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus.Engineering Sciences, 2014, 16(9): 26–32 [侯吉倫, 李超,王桂興, 等. 牙鲆連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系的遺傳特征分析. 中國工程科學(xué), 2014, 16(9): 26–32]

Huang YC, Ai HS, Pan ZC, et al. Establishment and WSSV resistant characteristics of selective breeding families for resistance to the white spot syndrome virus of Litopenaeus vannamei. Journal of Fisheries of China, 2013, 37(3):359–366 [黃永春, 艾華水, 潘忠誠, 等. 凡納濱對蝦抗WSSV選育家系的建立及其抗病特性. 水產(chǎn)學(xué)報, 2013,37(3): 359–366]

Li NQ, Yu LJ, Fu XZ, et al. Construction of Edwardsiella tarda ghosts from eel and their optimization of preparation conditions. Journal of Fisheries of China, 2012, 36(11):1754–1762 [李寧求, 余露軍, 付小哲, 等. 鰻源遲緩愛德華氏菌菌蛻的構(gòu)建及制備條件優(yōu)化. 水產(chǎn)學(xué)報, 2012,36(11): 1754–1762]

Liu Y, Jiang M, Jiang GL, et al. Effect of injection of Edwardsiella tarda on the immune organ of bastard halibut(Paralichthys olivaceus). Marine Sciences, 2000, 24(12):42–46 [劉云, 姜明, 姜國良, 等. 遲緩愛德華氏菌對牙鲆免疫器官的影響. 海洋科學(xué), 2000, 24(12): 42–46]

Ma AJ, Guo JL, Wang XA, et al. Family selection and estimation of disease resistance in turbot, Scophthalmus maximus.Journal of Fishery Sciences of China, 2014, 21(3): 484–493[馬愛軍, 郭建麗, 王新安, 等. 大菱鲆選育家系抗鰻弧菌性能. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2014, 21(3): 484–493]

Qi WS, Tian YS, Jiang J, et al. Establishment and identification of mitotic gynogenesis Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) pure family. Journal of Agricultural Biotechnology,2014, 22(5): 541–551 [齊文山, 田永勝, 姜靜, 等. 牙鲆卵裂雌核發(fā)育純系的建立及鑒定. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2014,22(5): 541–551]

Si F, Sun ZH, Yu SS, et al. Analysis of the genetic variability of the captured population of Japanese flounder Paralichthys olivaceus in the coastal releasing area of Qinhuangdao. Progress in Fishery Sciences, 2017, 38(6):18–24 [司飛, 孫朝徽, 于姍姍, 等. 秦皇島近海增殖放流區(qū)牙鲆(Paralichthys olivaceus)回捕群體的遺傳多樣性分析. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2017, 38(6): 18–24]

Sun HJ, Chen SL, Zheng WW, et al. Screening for resistance to Edwardsiella tarda in different families of Japanese flounder,Paralichthys olivaceus. Journal of Fishery Sciences of China,2015, 22(6): 1115–1122 [孫何軍, 陳松林, 鄭衛(wèi)衛(wèi), 等. 抗遲緩愛德華氏菌病牙鲆家系的篩選與分析. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2015, 22(6): 1115–1122]

Tian YS, Chen SL, Xu TJ, et al. The comparison of growth performances of Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)families and selection of parents with good trait. Journal of Fisheries of China, 2009, 33(6): 901–911 [田永勝, 陳松林,徐田軍, 等. 牙鲆不同家系生長性能比較及優(yōu)良親本選擇. 水產(chǎn)學(xué)報, 2009, 33(6): 901–911]

Wang L, Chen SL, Zhang YP, et al. Comparative analysis of disease resistance among three successive generations of Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) families. Journal of Fishery Sciences of China, 2013, 20(5): 990–996 [王磊,陳松林, 張英平, 等. 牙鲆連續(xù)三代抗鰻弧菌病家系的篩選與分析. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2013, 20(5): 990–996]

Wang ZM, Zhang WX, Feng LX, et al. Isolation and identification of the pathogenic bacteria of the white intestine disease in Paralichthys olivaceus. Hebei Fisheries,2005(1):11–15 [王志敏, 張文香, 馮力霞, 等. 牙鲆仔魚腸道白濁病病原菌的分離鑒定. 河北漁業(yè), 2005(1):11–15]

Xu TJ, Chen SL, Tian YS, et al. Comparative analysis of disease resistance among Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)families. Journal of Fishery Sciences of China, 2010, 17(1):59–68 [徐田軍, 陳松林, 田永勝, 等. 牙鲆抗鰻弧菌病家系篩選及其分析. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2010, 17(1): 59–68]

Zhang XJ, Zhan WB, Chen CZ, et al. Studies on the infection and pathogen of Edwardsiella tarda in flounder Paralichthys olivaceus. Acta Hydrobiologica Sinica, 2005, 29(1): 31–37[張曉君, 戰(zhàn)文斌, 陳翠珍, 等. 牙鲆遲鈍愛德華氏菌感染癥及其病原的研究. 水生生物學(xué)報, 2005, 29(1): 31–37]

Zhang YP, Chen SL, Sun HJ, et al. Establishment and analysis of Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) families with enhanced disease resistance to Edwardsiella tarda. Journal of Fisheries of China, 2014, 38(9): 1917–1925 [張英平, 陳松林, 孫何軍, 等. 牙鲆抗遲緩愛德華菌病家系建立與抗病性能評價. 水產(chǎn)學(xué)報, 2014, 38(9): 1917–1925]

Zheng WW, Chen SL, Li ZY, et al. Analyzing of heritability and breeding value of disease resistance for Edwardsiella tarda in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus). Journal of Agricultural Biotechnology, 2016, 24(8): 1181–1189 [鄭衛(wèi)衛(wèi), 陳松林, 李澤宇, 等. 牙鲆抗遲緩愛德華氏菌性狀的遺傳力和育種值分析. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2016, 24(8):1181–1189]

Zhu JJ, Li LP, Zhou Y, et al. Family establishment and disease resistance of different families of GIFT Nile tilapia Oreochromis niloticus. South China Fisheries Science, 2012,8(6): 22–27 [朱佳杰, 李莉萍, 周宇, 等. 吉富羅非魚家系構(gòu)建及抗病力檢測. 南方水產(chǎn)科學(xué), 2012, 8(6): 22–27]