成熟期增生性瘢痕與正常皮膚來源表皮干細(xì)胞生物學(xué)特性的對比研究

徐永飛 張建文 劉林嶓 周樹萍

[摘要]目的：探討成熟期增生性瘢痕與正常皮膚來源表皮干細(xì)胞的生物學(xué)特性。方法：選擇本院成熟期增生性瘢痕患者病理組織，正常皮膚為本院行游離皮片移植術(shù)患者的全厚皮片，分別進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲取種子細(xì)胞，利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測角蛋白19、整合素β1在兩組中的表達(dá)情況，應(yīng)用CCK-8檢測兩組表皮干細(xì)胞生長曲線，酶標(biāo)儀檢測兩組表皮干細(xì)胞450～630nm的吸光度值。結(jié)果：角蛋白19及整合素β1在兩組中均呈陽性表達(dá)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；且兩組表皮干細(xì)胞具有相似的生長曲線，其不同時(shí)間的450～630nm吸光度值比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：成熟期增生性瘢痕組織中也存在表皮干細(xì)胞，且與正常皮膚來源表皮干細(xì)胞具有相近的生物學(xué)特性，為整形外科中成熟期增生性瘢痕組織表皮的再利用提供理論基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]增生性瘢痕；表皮干細(xì)胞；生物學(xué)特性；整形外科；缺損；修復(fù)

[中圖分類號]R619+.6 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）04-0102-03

Comparative Study of Biological Characteristics of Epidermal Stem Cells from Human Hypertrophic Scar in Mature and Normal Skin

XU Yong-fei1，ZHANG Jian-wen2，LIU Lin-bo2，ZHOU Shu-ping3

（1.Department of Plastic Surgery，Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Luoyang 471000，Henan，China；

2.Department of Plastic Surgeny， the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，Henan，China；

3.Department of Microsurgery，NO.153 Central Hospital of the PLA，Zhengzhou 450000，Henan，China）

Abstract： Objective To investigate the biological characteristics of mature epidermal stem cells derived from hypertrophic scars and normal skin. Methods The pathological tissues of patients with mature hypertrophic scar were selected. The normal skin came from the full-thickness skin slices of free skin graft in our hospital. They were isolated and cultured respectively to obtain seed cells. Immunocytochemistry was used to detect the expression of keratin 19 and integrin β1 in both groups. The growth curve of epidermal stem cells and the absorbance of 450～630nm were detected by CCK-8 and microplate reader. Results Keratin 19 and integrin β1 in both groups were positive expression， and the difference was not statistically significant （P>0.05）. Two groups of epidermal stem cells had similar growth curves， and there were no significant difference in absorbance value between 450 and 630nm at different time（P>0.05）. Conclusion Epidermal stem cells also exist in mature hypertrophic scars， and have similar biological characteristics with normal skin derived epidermal stem cells， which provides a theoretical basis for the reutilization of hypertrophic scar tissue in the orthopedic period.

Key words： hypertrophic scars； epidermal stem cells； biological characteristics； plastic surgery； defect； repair

瘢痕是是創(chuàng)面愈合的最終結(jié)果，不僅影響美觀，而且常伴畸形及功能障礙，嚴(yán)重影響身心健康，臨床上常主張手術(shù)治療[1]，手術(shù)原則為徹底切除瘢痕組織，以游離皮片或皮瓣覆蓋創(chuàng)面，最大限度的恢復(fù)患者外觀及功能[2]，但從正常皮膚中獲取游離皮片或皮瓣必然會(huì)帶來新的創(chuàng)傷。瘢痕組織的表皮能否再利用已成為目前討論的熱點(diǎn)[3]。本研究旨在探討人成熟期增生性瘢痕與人正常皮膚來源表皮干細(xì)胞的生物學(xué)特性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：PBS液、4%多聚甲醛（UBIO，中國）、無水乙醇、酒精、正丁醇、二甲苯、石蠟、中性樹膠；激光掃描共聚焦顯微鏡、Megafuge離心機(jī)、組織包埋機(jī)、全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、倒置相差顯微鏡。

1.2 成熟期增生性瘢痕組織：成熟期增生性瘢痕組織來源于2012年7月-2015年7月于本院整形外科行瘢痕切除的20例患者，均經(jīng)病理證實(shí)。其中男12例，女8例；年齡20～75歲，平均46歲；致病原因：燒傷、外傷、手術(shù)及皮膚感染等。正常皮膚來源于同期本院行游離皮片移植術(shù)的20例患者的全厚皮片，其中男11例，女9例；年齡18～74歲，平均46歲。兩組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者6個(gè)月內(nèi)病變組織無破潰、感染及癌變等；②6個(gè)月內(nèi)未口服抗瘢痕藥物或激素類藥物者；③6個(gè)月內(nèi)未接受放射治療者；④無精神性疾病及相關(guān)器質(zhì)性疾病。所有患者對本研究知情同意并簽署相關(guān)知情同意書。

1.3 表皮干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定：將手術(shù)獲取的瘢痕組織和正常皮膚于無菌環(huán)境下帶入實(shí)驗(yàn)室，均修剪為1.0cm×0.3cm中厚皮片，用PBS液沖洗獲取組織，加入DiapaseⅡ，再次用PBS液進(jìn)行沖洗，過濾上清液并分離獲得表皮組織，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，分散細(xì)胞，除去上清液，獲取細(xì)胞懸液，放置于無菌培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)，并更換KM培養(yǎng)基，并分別加入胰蛋白酶和膠原，再次更換KM培養(yǎng)基，此時(shí)分離培養(yǎng)的細(xì)胞即為種子細(xì)胞。利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測表皮干細(xì)胞的陽性標(biāo)記物角蛋白19、整合素β1對兩組中是否存在表皮干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。角蛋白19陽性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞漿呈紅色熒光，整合素β1陽性表現(xiàn)為細(xì)胞膜呈紅色熒光[4]。

1.4 檢測指標(biāo)：使用酶標(biāo)儀檢測兩組表皮干細(xì)胞450～630nm的吸光度值，吸光度值越高，表明表皮干細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)[5]，并連續(xù)檢測其7d生長曲線。參照Constantine的標(biāo)準(zhǔn)，高倍鏡（200×）綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量測定：按照染色強(qiáng)度（無染色為0分，淡染色為1分，黃色2分，棕褐色3分）和陽性細(xì)胞數(shù)（在400倍光鏡下至少5個(gè)視野，細(xì)胞陽性數(shù)≤1%為0分，1%～10%為1分，10%～20%為2分，≥20%為3分）統(tǒng)計(jì)記分，以上兩項(xiàng)相加為總分，0分為陰性（-），1～2分為（+），3～4分（++），5～6分為（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)采用SPSS l8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用樣本均數(shù)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表皮干細(xì)胞鑒定結(jié)果：角蛋白19、整合素β1在兩組組織中均呈陽性表達(dá)，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），證明成熟期增生性瘢痕組織中同樣存在表皮干細(xì)胞。見表1，圖1～4。

表1 角蛋白19和整合素β1在兩組組織中的表達(dá)情況 （n=20，例）

分組 角蛋白19總分分級 整合素β1總分分級

- + ++ +++ - + ++ +++

增生性瘢痕組 0 3 15 2 0 4 15 1

正常皮膚組 0 4 16 0 0 5 15 0

χ2值 0.934 0.963

P值 0.334 0.328

2.2 生長曲線：兩組總體生長趨勢大致相同，第1～2天生長緩慢，第3～4天生長迅速，第5天達(dá)到高峰，第6～7天相對平穩(wěn)，形成一個(gè)平臺期。兩組表皮干細(xì)胞生長曲線大致相同，見圖5。

圖5 兩組表皮干細(xì)胞生長曲線

2.3 吸光度值：瘢痕組表皮干細(xì)胞與正常皮膚組表皮干細(xì)胞吸光度值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

增生性瘢痕是創(chuàng)傷愈合留下的痕跡，也是組織修復(fù)愈合的最終結(jié)果，輕者影響美觀，重者影響功能，給患者身心可帶來巨大影響，臨床上對于嚴(yán)重影響患者功能的增生性瘢痕，常采用手術(shù)治療，完全切除瘢痕組織，徹底松解皮膚，缺損創(chuàng)面以游離皮片或皮瓣覆蓋，最大限度的恢復(fù)患者的功能及外觀[6-8]。然而，切除的瘢痕組織常被廢棄，以機(jī)體其它部位的游離皮片或皮瓣去修復(fù)創(chuàng)面必然會(huì)帶來新的創(chuàng)傷[9]。表皮干細(xì)胞存在于皮膚中，通過其不斷的增殖及分化，維持皮膚結(jié)構(gòu)及功能的完整性[10]。近年來，隨著表皮干細(xì)胞研究的不斷深入，從生物細(xì)胞學(xué)角度講表皮干細(xì)胞應(yīng)用于臨床已成為研究熱點(diǎn)[11-12]。周樹萍等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)增生性瘢痕成熟，即穩(wěn)定后，其能夠進(jìn)行穩(wěn)定的新陳代謝，從而維持瘢痕組織皮膚組織結(jié)構(gòu)完整性及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性?；诖?，本研究推測成熟期增生性瘢痕組織具有表皮干細(xì)胞，并針對其生物學(xué)特性與正常皮膚表皮干細(xì)胞進(jìn)行了對比研究。

謝一帆等[14]研究發(fā)現(xiàn)，表皮干細(xì)胞能夠特異性表達(dá)角蛋白19、整合素β1。Yoshikawa K等[15]的研究發(fā)現(xiàn)瘢痕組織中細(xì)胞的生長曲線及第1～7天吸光度值可反應(yīng)細(xì)胞生長能力。本研究分兩部分進(jìn)行，第一部分利用免疫組織化學(xué)方法證明兩組表皮組織中表皮干細(xì)胞的存在；第二部分從增殖能力方面對比性研究兩組表皮干細(xì)胞的生物學(xué)特性。本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來源于本院成熟期增生性瘢痕患者，發(fā)病均在2年以上，且臨床表現(xiàn)趨于穩(wěn)定，顏色變淡，質(zhì)地變軟，并經(jīng)病理證實(shí)，采用中性蛋白酶消化分離瘢痕真皮細(xì)胞，避免真皮細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)帶來干擾，將表皮組織進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得種子細(xì)胞，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對其特異性標(biāo)志物角蛋白19、整合素β1進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明角蛋白19、整合素β1在兩組均呈陽性表達(dá)，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明所獲得的種子細(xì)胞均為表皮干細(xì)胞，從而證明成熟期增生性瘢痕組織表皮與正常皮膚表皮均存在表皮干細(xì)胞，這與相關(guān)研究相符。通過繪制兩組表皮干細(xì)胞的生長曲線及第1～7天吸光度值檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組表皮干細(xì)胞均呈S形生長，生長曲線相似，且吸光度值無明顯差異。

本實(shí)驗(yàn)從兩方面證明，成熟期增生性瘢痕組織中存在表皮干細(xì)胞，且其生物學(xué)特性與正常皮膚來源表皮干細(xì)胞相似，提示臨床上切除的瘢痕組織可以再利用，提取瘢痕組織的表皮組織可作為創(chuàng)面修復(fù)的皮片來源。但本研究不足之處在于僅僅通過組織化學(xué)及增殖能力方面對表皮干細(xì)胞進(jìn)行研究，要全面應(yīng)用于臨床，有待于之后從基因?qū)W及蛋白學(xué)角度進(jìn)一步進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)研究。

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