?；切苋パ跄懰嵴T導(dǎo)牙髓干細(xì)胞的成骨分化實(shí)驗(yàn)研究

陳福揚(yáng) 孫艷艷 譚金娣 于易秀 劉明月 史欣 胡偉平

[摘要]目的：研究?；切苋パ跄懰幔═auroursodeoxycholic acid，TUDCA）對(duì)牙髓干細(xì)胞 （Dental pulp stem cells，DPSCs）增殖及成骨向分化的作用。方法：用不同質(zhì)量濃度（0、10、100、30OnM）的TUDCA培養(yǎng)DPSCs，利用甲基噻唑基四唑（Methylthiazolylterrazolium，MTT）法計(jì)數(shù)檢測(cè)不同濃度TUDCA對(duì)細(xì)胞增殖的影響；7d后測(cè)定不同濃度TUDCA誘導(dǎo)后的堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性；倒置相差顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后的DPSCs形態(tài)變化；應(yīng)用茜素紅染色法檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)的形成。結(jié)果：MTT法及ALP活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明，隨著TUDCA濃度的增加，ALP活性增強(qiáng)，細(xì)胞增殖率升高。茜素紅染色顯示TUDCA誘導(dǎo)培養(yǎng)28d后出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)。結(jié)論：TUDCA可促進(jìn)DPSC增殖和成骨分化。

[關(guān)鍵詞]牙髓干細(xì)胞；牛磺熊去氧膽酸；細(xì)胞增殖；成骨分化；新型生物材料；組織工程

[中圖分類號(hào)]R329.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）03-0097-04

Taursodeoxycholic Acid Induced the Osteogentic Differentiation Ability of Dental Pulp Stem Cells

CHEN Fu-yang1，SUN Yan-yan2，TAN Jin-di1，YU Yi-xiu1，LIU Ming-yue1，SHI Xin1，HU Wei-ping1

（1.Department of Prosthodontics，the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086，Heilongjiang，China；2.Department of Prosthodontics，Xuzhou Stomatology Hospital，Xuzhou 221000，Jiangsu，China）

Abstract： Objective To study the effect of tauroursodeoxycholic acid （TUDCA） on the proliferation and osteogenic differentiation in dental pulp stem cells （DPSCs）. Methods Methylthiazolyltetrazolium （MTT） assay was used to evaluate the proliferation rate of DPSCs induced by different concentrations of TUDCA（0，10，100，300nM）. The activity of alkaline phosphatase （ALP） after induced by different concentration of TUDCA was measured. We observed the morphologica1 changes of DPSCs by the inverted phase contrast microscope， detected the mineralize nodules stained by Alizarin red. Results The results of MTT and ALP activity measurement showed that ALP activity increased and cell proliferation rate arise with the increase of concentration of TUDCA. Alizarin red staining showed that mineralized nodules have formed after induced by TUDCA for 28 day. Conclusion TUDCA can promote the proliferation and osteogenic differentiation of DPSCs.

Key words： dental pulp stem cells； taursodeoxycholic acid； cell proliferation； osteogenic differentiation； new biomaterials； tissue engineering

組織工程再生或缺損組織修復(fù)是目前很有前途的臨床治療方法[1-2]。近年來，許多臨床醫(yī)生和研究人員一直致力于組織工程領(lǐng)域研究，很多研究報(bào)道用生物材料和細(xì)胞誘導(dǎo)組織再生：包括合成天然蛋白和生長因子[2-5]。雖然組織工程學(xué)的研究改進(jìn)了臨床治療的特異性組織缺損，但是在組織工程中的廣泛應(yīng)用還是受到了限制和障礙，例如功能和新生組織形態(tài)維持。在組織工程中骨修復(fù)往往缺乏血管和機(jī)械強(qiáng)度，很難實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的骨微結(jié)構(gòu)[6]。

以往研究知道，BMP系列、地塞米松具有強(qiáng)大的骨誘導(dǎo)能力。2002年以來，在骨科中一直應(yīng)用BMP-2、地塞米松。然而，進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，這些治療過程中需要大量昂貴的生長因子和細(xì)胞因子[7-8]，并且細(xì)胞毒性和炎癥對(duì)最后骨組織形成的成功與否都起著重要的作用，從而影響治療效果[9-10]。因此，需要發(fā)現(xiàn)新的藥物和因子來增強(qiáng)骨組織再生的成功率和術(shù)后效果。化學(xué)藥物?；切苋パ跄懰幔═auroursodeoxycholic acid，TUDCA）的出現(xiàn)和研究對(duì)這一難題帶來了解決辦法。?；切苋パ跄懰崾且环N已被美國食品和歐洲藥物管理局批準(zhǔn)的藥物[11-12]。其具有解痙、抗驚厥、抗炎及溶膽石等作用。臨床主要用于治療膽囊膽固醇結(jié)石、原發(fā)硬化性膽管炎、原發(fā)膽汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等[11-12]。最近報(bào)道了TUDCA顯著增加了體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）的成骨化[13]。牙髓干細(xì)胞（Dental pulp stem cells，DPSCs）與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞都具自我增殖和多種分化能力，在牙齒再生骨組織工程等方面發(fā)揮著重要作用，可以作為骨組織工程研究的理想種子細(xì)胞[14-19]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯啃滦蜕锊牧吓；切苋パ跄懰釋?duì)牙髓干細(xì)胞成骨向分化的影響。

1 材料和方法

1.1 材料：胎牛血清（Hyclone，美國）；DMEM/F-12（Hyclone，美國）；?；切苋パ跄懰幔⊿igma，美國20mg）；I型膠原酶（Gibco，美國）；0.25%胰酶（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；青霉素和鏈霉素（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；磷酸鹽緩沖液（Phosphate-buffered saline，PBS）；茜素紅（Alizarin red S，Sigma，美國）；堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）；甲基噻唑基四唑（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、DMSO、抗壞血酸、B-甘油磷酸鈉、L-谷氨酰胺、地塞米松（Sigma，美國）。

1.2 牙髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定：選擇哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔外科門診采集的因正畸拔除的正常前磨牙或阻生的正常第三磨牙（患者年齡14～25歲），所有成年患者及未成年患者家屬均知情同意。依據(jù)Gronthos[15]原代細(xì)胞培養(yǎng)法，劈開實(shí)驗(yàn)牙，用鑷子取出牙髓，含雙抗PBS充分沖洗置于體積分?jǐn)?shù)為0.3%的I型膠原酶培養(yǎng)皿中將牙髓組織剪成約1mm×lmm×1mm的組織塊，移入離心管中在37℃的水域振蕩器中消化40min，去除上清液， 加入4ml含20%胎牛血清的培養(yǎng)液，l 000×g離心5min，共離心2次，去上清液，加入3ml培養(yǎng)液吹打混勻，最后移入培養(yǎng)瓶中，37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周換液2次。電鏡下觀察到細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，為牙髓干細(xì)胞典型形態(tài)。待細(xì)胞覆蓋瓶底的80%左右時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，以1：2的比例傳代。

1.3 傳代培養(yǎng)DPSCs：擦拭超凈工作臺(tái)，紫外燈下照射消毒30min。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)，置于超凈工作臺(tái)上，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，PBS溶液清洗3次。將胰酶消化液1～2ml置于培養(yǎng)瓶中，后將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中30s。將培養(yǎng)瓶自培養(yǎng)箱中取出，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞由長梭形變?yōu)閳A形時(shí)立即終止消化。于超凈工作臺(tái)上倒掉胰酶消化液，加入10ml含15%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液，用吸管將貼附于瓶壁的細(xì)胞吹打脫落。

1.4 DPSCs多向分化能力（成脂，成軟骨，成骨）：取第3代DPSCs細(xì)胞，分別用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的培養(yǎng)液為5mM β-glycerophosphate，50mg/ml vitamin-C-phosphate 和2mM L-glutamine，培養(yǎng)3周。用成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)的培養(yǎng)液為50μmol/L indomethacin，0.5μmol/L isobutylmethylxanthine和0.5μmol/L dexamethasone，培養(yǎng)2周。用成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)的培養(yǎng)液為6μg/ml Insulin，10ng/ml TGF-β1，95μmol/ml dexamethasone，37mg/ml vitamin-C-phosphate，0.8μmol/ml sodium Pyruvate，6μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白。然后用油紅O染色檢測(cè)向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)情況；甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)向成軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)情況；茜素紅（Alizarin Red S）染色檢測(cè)成骨細(xì)胞誘導(dǎo)情況。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：實(shí)驗(yàn)共分4組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，將第3代DPSCs以5 000個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后更換為含有不同質(zhì)量濃度的TUDCA（0、10、100、30OnM）培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后第l、3、5、7、9天用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.6 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性測(cè)定：將第3代DPSCs以5 000個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后分別用含有不同質(zhì)量濃度的TUDCA（0、10、100、30OnM）培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每組6個(gè)復(fù)孔，于誘導(dǎo)培養(yǎng)的第7天棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，在每孔中加入1% TritonX-100裂解液30μl覆蓋滿細(xì)胞，裂解30min，按說明書操作，加入基質(zhì)液和緩沖液各5Oμl，充分混勻后37℃水浴15min，加入顯色劑150μl，用酶標(biāo)儀測(cè)量490nm處吸光度值（A490nm），比較各組細(xì)胞ALP活性。

1.7 茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色測(cè)定：將第3代細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，分為4組，24h后將培養(yǎng)液更換為含有不同質(zhì)量濃度TUDCA（0、10、100、30OnM）培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)至28d進(jìn)行茜素紅染色，PBS緩沖液沖洗3次，95%無水乙醇固定15min，蒸餾水沖洗3次，0.1%茜素紅-Tris-HC1（pH=8.3）37℃孵育30min，蒸餾水沖洗，干燥，拍照，觀察各組礦化結(jié)節(jié)形成情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，行單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)情況：原代培養(yǎng)DPSCs，細(xì)胞在第4天貼培養(yǎng)瓶壁生長，隨后至第7天形成克隆細(xì)胞團(tuán)并具有典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。培養(yǎng)14d后，克隆的細(xì)胞形態(tài)更統(tǒng)一，具有成纖維形態(tài)和長細(xì)胞突，平行排列并達(dá)到足夠數(shù)量等待傳代。傳代后，細(xì)胞增殖迅速。見圖1。

注：A.DPSCs培養(yǎng)第4天的形態(tài)；B.DPSCs增殖至第7天，典型的成纖維樣形態(tài)；C.細(xì)胞排列呈柵欄狀；D.DPSCs傳代后，增殖進(jìn)入活躍期

圖1 DPSCs 細(xì)胞形態(tài)（40×）

2.2 DPSCs多向分化能力體外鑒定結(jié)果：細(xì)胞成脂誘導(dǎo)3周，成骨誘導(dǎo)礦化結(jié)節(jié)形成，顯示礦化成功，見圖2A；油紅O染色形成中間為空泡的脂肪細(xì)胞，見圖2B；細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)3周，甲苯胺藍(lán)染色形成藍(lán)色結(jié)節(jié)，見圖2C。

注：A.Alizarin Red S檢測(cè)成骨分化的礦化基質(zhì)沉積情況；B.成脂分化顯示通過Oil Red O染色中性脂質(zhì)聚集；C.甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)成軟骨分化情況

圖2 DPSCs多向分化能力檢測(cè)結(jié)果（40×）

2.3 細(xì)胞增殖MTT檢測(cè)結(jié)果：3組DPSCs在1～9d均呈現(xiàn)不同程度的生長狀態(tài)。3種不同質(zhì)量濃度的TUDCA對(duì)牙髓干細(xì)胞都有促進(jìn)作用，并且隨著TUDCA的濃度的升高促進(jìn)增殖作用逐漸提高，特別是含300nM TUDCA組與其他組相比差異明顯，10nM TUDCA組與培養(yǎng)液組相比無明顯差距。見圖3。

圖3 三組DPSCs培養(yǎng)1～9d細(xì)胞增殖情況

2.4 ALP活性檢測(cè)結(jié)果：將第3代DPSCs誘導(dǎo)9d后，牛磺熊去氧膽酸對(duì)人牙髓干細(xì)胞ALP活性有促進(jìn)作用，對(duì)照組、10nM、100nM、300nM TUDCA組的ALP活性分別為0.08403±0.06275、0.20808±0.0835、0.26392±0.0846、0.38267±0.1022，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.5 礦化結(jié)節(jié)檢測(cè)結(jié)果：取克隆化第3代DPSCs培養(yǎng)28d，可見部分細(xì)胞發(fā)生成骨細(xì)胞樣多角形以及錐體形態(tài)改變。DPSCs在礦化誘導(dǎo)后逐漸產(chǎn)生白色點(diǎn)狀晶體。經(jīng)茜素紅染色后光學(xué)顯微鏡下均可見橘紅色礦化結(jié)節(jié)，呈團(tuán)狀或條狀不規(guī)則形態(tài)。對(duì)比后發(fā)現(xiàn)300nM TUDCA組可見數(shù)目多、面積較大的橘紅色礦化結(jié)節(jié)，因此證明成骨活性活性更強(qiáng)（見圖4）。

注：A.10nM TUDCA組；B.100nM TUDCA組；C.300nM TUDCA組

圖4 牙髓干細(xì)胞礦化誘28d后礦化結(jié)節(jié)染色結(jié)果（茜素紅染色低倍放大，40×）

3 討論

牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞是種子細(xì)胞，來源廣泛，取材方便，具有自我更新和多向分化能力，體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)其具有很強(qiáng)的成骨能力。種子細(xì)胞是作為骨組織工程的關(guān)鍵因素，探尋合適的對(duì)象，優(yōu)化培養(yǎng)條件，真正實(shí)現(xiàn)體外成骨，形態(tài)可塑，對(duì)治療嚴(yán)重骨缺損具有重要的意義[20-25]。從目前研究來看，雖然組織工程學(xué)的研究改進(jìn)了臨床治療的特異性組織缺損，但是在組織工程中的廣泛應(yīng)用還是受到限制和障礙，例如功能和新生組織形態(tài)維持。在組織工程中骨修復(fù)往往缺乏血管和機(jī)械強(qiáng)度，很難實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的骨微結(jié)構(gòu)[6]。

以往研究發(fā)現(xiàn)，BMP系列、地塞米松等都具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)骨組織再生的能力，也已經(jīng)在臨床得到了進(jìn)一步應(yīng)用和發(fā)展，但是正是在不斷的發(fā)展中，發(fā)現(xiàn)了各種問題，其不僅價(jià)格昂貴，還具有細(xì)胞毒性和術(shù)后炎癥反應(yīng)，對(duì)于最終臨床患者的應(yīng)用帶來了一定風(fēng)險(xiǎn)和不良預(yù)后。近幾年，越來越多的研究者們正在嘗試各種新型生物材料，而?；切苋パ跄懰岬难芯颗c進(jìn)展給予了骨組織工程希望。

?；切苋パ跄懰嶙鳛橐环N治療痙攣、抗驚厥、抗炎及溶膽石等作用的藥物，隨著Byung-Hyun Cha等[13]研究發(fā)現(xiàn)?；切苋パ跄懰峥梢源龠M(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，通過抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞都是作為種子細(xì)胞，屬于多能干細(xì)胞。通過?；切苋パ跄懰釋?duì)于體內(nèi)小鼠的骨再生的研究，發(fā)現(xiàn)小鼠骨再生的支架生物相容性非常好，能夠增加置入組織的血管化，血管化、骨再生和骨融合是骨缺損移植修復(fù)的重要環(huán)節(jié)。這使得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與?；切苋パ跄懰嶂g相互作用的研究成為了熱點(diǎn)。

ALP是一種分泌型蛋白，他的表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)，參與鈣化組織的形成、代謝和再生，其活性的高低可以反映不同組織、細(xì)胞的礦化能力以及向成骨方向分化的趨勢(shì)。間充質(zhì)干細(xì)胞礦化的另一個(gè)經(jīng)典指標(biāo)是礦化結(jié)節(jié)，是一種比ALP更晚期的檢測(cè)指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中通過MTT檢測(cè)顯示細(xì)胞在加入TUDCA培養(yǎng)液的第9天已到達(dá)細(xì)胞增殖的頂峰，同時(shí)檢測(cè)了第9天ALP的活性，300nM組的ALP活性變化最顯著。根據(jù)Byung-Hyun Cha等研究[13]，為了能夠更好地取得實(shí)驗(yàn)效果，本次將TUDCA的質(zhì)量濃度分為（0、10、100、30OnM）4組，0nM作為對(duì)照組。MTT結(jié)果顯示TUDCA作用后的DPSCs的增殖情況和成骨分化能力的改變，表明TUDCA具有促進(jìn)DPSCs增殖的能力。這與TUDCA在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞研究結(jié)果一致。不同質(zhì)量濃度TUDCA的ALP活性呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，本次分組中300nM組活性最高，各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨后又繼續(xù)進(jìn)行茜素紅染色實(shí)驗(yàn)，得出的結(jié)論與MTT，ALP的檢測(cè)結(jié)果一致。

?；切苋パ跄懰釋?duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有促進(jìn)成骨分化的作用。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TUDCA對(duì)于牙髓干細(xì)胞的成骨分化具有重要作用。對(duì)于開展口腔頜面部缺損的修復(fù)帶來一次機(jī)遇。300nM TUDCA實(shí)驗(yàn)組對(duì)于牙髓干細(xì)胞的成骨分化促進(jìn)效果最明顯，證實(shí)?；切苋パ跄懰嵴T導(dǎo)人DPSCs是一種可行、有效的促進(jìn)成骨活性的方法，與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

?；切苋パ跄懰嶙鳛橐环N藥物，在臨床應(yīng)用中才能證實(shí)其在骨再生方面的能力，應(yīng)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究其在體內(nèi)的成骨作用，并對(duì)牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的潛在藥物作用機(jī)制進(jìn)一步研究。為了最大限度地提高骨形成和減少潛在副作用，應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定藥物最佳劑量，進(jìn)行大型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以確定骨再生效果。

綜上，本研究表明TUDCA能促進(jìn)DPSCs分化為骨組織，盡管需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，但此研究表明了一種新型的促進(jìn)成骨分化的新型生物材料，牛磺熊去氧膽酸有著廣闊的研究前景。

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