基于單光子計數(shù)的水稻真菌病害孢子活性檢測的方法

馮冠潮

摘要：本項目通過單光子計數(shù)器對水稻真菌病害孢子活性進行檢測，通過使用微流控芯片配合單光子計數(shù)器簡化原有檢測過程，縮短檢測周期，達到對于水稻病害包子的早期及時預測，具有巨大的經(jīng)濟效益和項目前景

關鍵詞：水稻真菌病害；單光子計數(shù)；縮短檢測周期

稻作為世界主要糧食作物之一。中國水稻播種面占全國糧食作物的1/3，而稻谷產(chǎn)量則糧食總產(chǎn)量的45%，同時我國65%以上的人口以大米為主食。水稻的產(chǎn)量又與水稻病害息息相關，稻瘟病、紋枯病和白葉枯病并稱水稻三大病害，每年對水稻生產(chǎn)造成巨大損失，其中稻瘟病、紋枯病都是由真菌引起。據(jù)統(tǒng)計，在現(xiàn)有防治水平下，全國平均每年水稻因水稻病害引起的減產(chǎn)達400-500萬噸，所以對由真菌引起的水稻病害的孢子檢測與預防工作刻不容緩。

針對上述水稻病害即稻瘟病、紋枯病，研究表明，這兩種病害都是由真菌引起，同時孢子傳播途徑都是空氣傳播。因此，對這兩類病害的最佳檢測手段就是對植株周邊空氣中致病孢子的濃度和活性進行檢測?，F(xiàn)階段，對植物取樣孢子活性的傳統(tǒng)檢測需要先將取得的樣品進行殺菌純化后經(jīng)行培養(yǎng)，如點植法、稀釋平板計數(shù)法等，然后通過化學染色法如亞甲基藍[8]或通過熒光素二乙酸酯等進行染色，再進行如直接顯微鏡記數(shù)法、最近似數(shù)測定法等進行計數(shù)測量得到孢子活性。這類方法雖然實驗過程簡單，成本低廉，對設備要求較低，但是測量周期較長，無法對水稻病害進行早期檢測和預防。隨著現(xiàn)代醫(yī)學免疫學和基因技術的發(fā)展，對孢子活性的檢測也產(chǎn)生了很多多樣化的手段，如多聚酶鏈式反應（PCR）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、直接表面熒光濾膜計數(shù)技術（DEFT）等[4，8]。由于水稻致病真菌的氣傳孢子具有濃度極低，孢子尺寸極小且樣本中雜菌、雜質(zhì)含量高的特，點現(xiàn)有檢測手段雖然可以準確測定孢子個體數(shù)量變化，但是由于檢測試劑如底物、輔酶的限制，對被測對象存在檢測的盲目性和滯后性。而且為了提高檢測結(jié)果，避免外界干擾，需要嚴格的實驗室環(huán)境和復雜的實驗過程，導致較高的設備需求和檢測成本。

光子計數(shù)器（PMT）是一種基于直接探測量子限理論的極微弱光脈沖檢測設備。它利用光電倍增管的單光子檢測技術，通過對電子計數(shù)器鑒別并測量單位時間內(nèi)的光子數(shù)，從而檢測離散微弱光脈沖信號功率[6]（見圖2）。由于光子計數(shù)器對微弱光照的敏感性，目前國內(nèi)外單光子計數(shù)法在微弱熒光生物測量方面有著較為廣泛運用，如通過基于時間相關單光子計數(shù)法測量生物組織光學參數(shù)[5]（見圖3）利用時間相關單光子計數(shù)法測量人體癌細胞的熒光光譜特性[10，11]。但是，目前的國內(nèi)單光子計數(shù)器對于孢子活性的熒光檢測方面研究尚存較大空白，首先并無可以直接進行檢測的針對性裝備，其次亦無對熒光強度與孢子活性間適配的數(shù)學模型。而且現(xiàn)存對其他對象的檢測方案對待測樣本的要求較高，需要經(jīng)過一定的預處理過程，對實驗設備有較高要求；同時檢測方案多為通過光子的散射和反射來間接測量樣本，后期數(shù)據(jù)處理過程較為復雜，計算量大。

本項目擬采用以下技術思路，技術路線如圖所示：

光傳孢子的特性以及分布模型選擇合適的微流控材料并設計特定的微流控芯片，設計并構(gòu)建光學通路，并創(chuàng)建基于單光子計數(shù)器的熒光檢測平臺，用熒光檢測平臺對目標孢子進行熒光檢測。通過實驗數(shù)據(jù)結(jié)合已有文獻資料建立數(shù)學模型，并用該數(shù)學模型進行軟件仿真以求復現(xiàn)數(shù)據(jù)。

本實驗主要研究內(nèi)容：

（1）、解決微流控芯片芯片對于氣傳孢子的純化、富集問題，尋找合適的對水稻氣傳孢子具有靶向檢測效果的熒光試劑；

（2）、解決單光子計數(shù)裝置與微流控芯片光學耦合的問題；

（3）、解決病害種類及程度與熒光光子吸收量間的模型關系問題；

平臺創(chuàng)建構(gòu)思：

（1）、解決微流控芯片芯片對于氣傳孢子的純化、富集問題，尋找合適的對水稻氣傳孢子具有靶向檢測效果的熒光試劑；

（2）、解決單光子計數(shù)裝置與微流控芯片光學耦合的問題；

（3）、解決病害種類及程度與熒光光子吸收量間的模型關系問題；

3、針對數(shù)學模型的建立問題：、

（1）、根據(jù)前期建立的孢子生化反應模型和物理空間分布特性模型結(jié)合實驗原始數(shù)據(jù)建立先期模型；

（2）、通過實驗結(jié)果與數(shù)學模型分析結(jié)果進行比對，修正數(shù)學模型。

（作者單位：江蘇大學）