HPLC法測定沙棘籽粕中槲皮素山柰酚和異鼠李素的含量

任梅娟，盧永昌，辛青霞，李 欣

(1.青海民族大學(xué) 藥學(xué)院，青海 西寧 810007；2.青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點實驗室，青海 西寧 810007；3.青海省藥物分析重點實驗室，青海 西寧 810007)

沙棘( Hippophae rhamnoides L.) 為多年生落葉灌木或小喬木，是一種喜光、耐水、耐旱、生長性極好的小漿果植物，多為橘黃色或橘紅色[1].我國主要分布在西北、華北、東北及西南等十多個省區(qū)，全國約有100 萬 hm2[2].現(xiàn)代科學(xué)研究表明，沙棘果與沙棘籽富含蛋白質(zhì)、氨基酸、有機酸、多種維生素以及微量元素等對人體有益的功能活性成分和營養(yǎng)成分，具有獨特的保健功能和藥用價值，享有“綠色黃金”的美譽[3].沙棘中的黃酮含量較高，主要是異鼠李素、槲皮素、山奈酚、楊梅素等黃酮苷元及其苷類.據(jù)報道，國外已分離出的沙棘黃酮類化合物有32種[4]，是因為這些豐富的黃酮類化合物，沙棘才具有了如治療心腦血管疾病(心肌缺血、心肌再灌注損傷、血栓)、抗癌、抗氧化、抗衰老、降血脂、降血糖、心臟保護等藥理作用[5].目前，工業(yè)上采用超臨界萃取沙棘油后，剩余的沙棘籽粕多為廢棄物.企業(yè)每年有大量沙棘籽粕無法處理，為探索沙棘籽粕的再利用，本試驗采用高效液相色譜法，測定了沙棘籽粕中槲皮素、山柰酚、異李鼠素三種黃酮甙元，獲得了滿意結(jié)果，可為沙棘籽粕的二次開發(fā)提供依據(jù).

1 材料

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器)；十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；SZ—97自動三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；FW7362M/24電子分析天平(德國制造)；KQ-3200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司).

1.2 藥品與試劑

沙棘籽粕購自青?？灯盏律镏破酚邢薰?

甲醇為色譜純，購自山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠；磷酸等均為分析純.

槲皮素(100081-201507)、山柰酚(110861-201504)、異鼠李素(110860-201406)三種對照品購自中國藥品生物制品檢定所.

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm).流動相：含0.04%磷酸的甲醇∶水=50∶50.流速：1 mL/min.檢測波長：360 nm.柱溫：35 ℃.在此色譜條件下槲皮素、山奈酚、異鼠李素等3種成分均被洗脫出來，并且達到基線分離，見圖1.

2.2 溶液的制備[6]

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取對照品槲皮素2.24 mg、山柰酚1.41 mg、異鼠李素2.20 mg，將其分別置于5 mL的容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，再配制成一定濃度對照品溶液，使用時稀釋成所需要的濃度.

2.2.2 供試品Ⅰ溶液(未水解樣品)的制備

精密稱取1.0 g，加入甲醇10 mL，超聲提取45分鐘，抽濾.以甲醇洗滌濾渣3次，每次2 mL.濾渣重復(fù)上述操作，所得濾液與前一次濾液合并，濃縮后定容至50 mL.過0.45 μm濾膜，在所選定色譜條件下測定有效成分的含量.

2.2.3 供試品Ⅱ溶液(水解樣品)的制備

精密稱取1.0 g，加入甲醇10 mL，超聲提取45分鐘，抽濾，以甲醇洗滌濾渣3次，每次2 mL.濾渣重復(fù)上述操作，所得濾液與前一次濾液合并，濃縮一定體積后，加甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合液25 mL，回流30 min，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加入甲醇定容，過0.45 μm濾膜，在所選定色譜條件下測定有效成分的含量.

2.3 線性關(guān)系試驗

分別精密量取3種對照品儲備液，用甲醇配制成濃度不同的混合對照品標(biāo)準(zhǔn)液系列溶液，每次進樣10 μL，測定色譜峰面積的積分值.以峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)，以進樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，測得槲皮素、山奈酚、異鼠李素的回歸方程，見表1.

表1標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 檢測限

在選定的色譜條件下，當(dāng)信噪比S/N=3時，對各組分最低檢測限進行測定.結(jié)果表明，測定槲皮素、山奈酚、異鼠李素含量的最低檢測限分別為0.25、0.38、1.2 ng.

2.5 精密度試驗

在選定的色譜條件下，量取一定濃度的槲皮素、山奈酚和異鼠李素的混合對照品溶液，測定色譜峰的峰面積，計算得RSD分別為0.64%、0.49%、0.92%(n=6).

2.6 重復(fù)性試驗

在選定的色譜條件下，精密稱取沙棘籽粕樣品0.5 g平行6份，分別加入甲醇10 mL，超聲提取45分鐘，抽濾.以甲醇洗滌濾渣3次，每次2 mL.濾渣重復(fù)上述操作，所得濾液與前一次濾液合并，濃縮后定容至50 mL.過0.45 μm濾膜，分別測定槲皮素、山奈酚、異鼠李素的含量，計算得RSD分別為1.4%、2.3%、2.7%(n=6).

2.7 穩(wěn)定性試驗

在選定的色譜條件下，精密稱取沙棘籽粕樣品0.5 g，分別加入甲醇10 mL，超聲提取45分鐘，抽濾.以甲醇洗滌濾渣3次，每次2 mL.濾渣重復(fù)上述操作，所得濾液與前一次濾液合并，濃縮后定容至50 mL.過0.45 μm濾膜，在2 h、4 h、8 h、12 h、24 h時分別進樣，計算槲皮素、山奈酚、異鼠李素的峰面積，計算得RSD分別為0.7%、0.9%、0.45%(n=5).表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.8 回收率試驗

精密稱取5份已測知含量的沙棘籽粕樣品各0.5 g，添加各對照品溶液適量，按“2.2”方法操作，測得槲皮素、山奈酚、異鼠李素平均回收率(n=5)分別為100.7%、98.7%、99.6%；RSD分別為2.6%、3.1%、1.2%，結(jié)果見表2.

表2回收率試驗結(jié)果(n=5)

2.9 樣品含量測定

在選定的色譜條件下，取“2.2”項下制備的樣品溶液，用DAD(二極管陣列)檢測器檢測上述3種待測組分的峰純度.待3種紫外光譜與對照品一致后，按外標(biāo)法，計算峰面積積分值，從而計算得3種有效成分的含量.每個樣品重復(fù)進樣3次，取其平均值.含量測定結(jié)果見表3.

表3沙棘籽粕中3種有效成分的含量(%，n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的確定

將對照品溶液進樣后，利用DAD(二極管陣列)檢測器在波長200～400 nm范圍掃描對照品溶液吸收光譜.3種對照品在238 nm波長處均有較高的吸收，而且干擾比較小，因此選擇238 nm為檢測波長.

3.2 流動相的選擇

經(jīng)過多次試驗，3種有效成分色譜峰容易拖尾.當(dāng)水中加入0.04%磷酸時可改善3種有效成分峰的拖尾現(xiàn)象，因此選擇甲醇和含0.04%磷酸的水作流動相.

3.3 結(jié)論

沙棘籽粕中黃酮類化合物主要有槲皮素、山奈酚、異鼠李素及其與各種糖形成的黃酮苷.水解與不水解樣品中各種組份的含量，發(fā)現(xiàn)水解與否對組份的含量的影響較小(見表3).為了簡化操作步驟，可采用不經(jīng)水解直接測定的方法.

通過測定發(fā)現(xiàn)沙棘籽粕，仍含有較高的槲皮素、山奈酚、異鼠李素等黃酮類化合物.沙棘籽粕可作為制備黃酮化合物的中間體或原料，可進一步提高沙棘籽粕的經(jīng)濟價值.

本文采用方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確、可靠等特點，為沙棘籽粕的綜合利用提供了依據(jù).同時該方法可用于沙棘及其產(chǎn)品的質(zhì)量評價.

[1] 張程慧，祁玉霞，程康蓉等.沙棘的綜合價值研究進展[J].食品工業(yè)科技，2017，38(21)：331-335.

[2] 郭興.利用沙棘果渣栽培黑木耳的研究[J].林業(yè)科技，2017，42(1)：42-44.

[3] 趙二勞，徐芬，尹愛萍等.沙棘果油與沙棘籽油脂肪酸組成及其抗氧化活性[J].中國油脂，2017，42(12)：120-123.

[4] 樊旭，周鴻立.沙棘黃酮含量的測定方法及其化學(xué)成分的研究進展[J].北方園藝，2018，(06)：120-123.

[5] 劉勇，廉永善，王穎莉等.沙棘的研究開發(fā)評述及其重要意義[J]中國中藥雜志，2014，39(9)：1547-1551.

[6] 宋永朋，馬華麗. HPLC法測定白刺籽中槲皮素和山萘酚的含量[J].食品研究與開發(fā)，2015，36(20)：131-133.