基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的HEK293T細(xì)胞DMD基因第51號(hào)外顯子的靶向敲除

李 雙，馬珊珊，崔思穎，屈素真，蔡奧捷，關(guān)方霞*，孔祥東*

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 遺傳與產(chǎn)前診斷中心， 河南 鄭州 450052； 2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 河南 鄭州 450001)

杜氏肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD,OMIM#310200)是最常見的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)遺傳病，為X-連鎖隱性，由DMD基因突變引起抗肌萎縮蛋白(dystrophin)合成障礙， 造成肌肉收縮不良[1]， 患

者常于20歲左右死于呼衰或心衰，臨床尚無有效治療方法。

DMD基因含79個(gè)外顯子，統(tǒng)計(jì)顯示約80%的DMD患者可通過跳躍特定外顯子修復(fù)閱讀框，恢復(fù)部分dystrophin表達(dá)[2]，其中可跳躍51外顯子(exon51)者約13%[3]?；蚓庉嬁蓮母旧闲迯?fù)突變基因，并通過細(xì)胞分裂穩(wěn)定傳遞。成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, associated RNA guided endonuclease Cas9, CRISPR/Cas9) 通過sgRNA(singe-guide RNA)5′端識(shí)別DNA，可實(shí)現(xiàn)對任意DNA序列的靶向修飾[4- 5]。若同時(shí)轉(zhuǎn)入多個(gè)sgRNA，則可完成對多個(gè)靶向位點(diǎn)或大片段基因編輯[6- 7]。本研究使用人胚腎上皮(HEK293T)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入靶向DMD基因exon51兩端的CRISPR/Cas9單載體質(zhì)粒系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對指定外顯子的敲除并提高了敲除效率，為DMD的基因治療及機(jī)制研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室所有；PX458/PX459質(zhì)粒(Addgene質(zhì)粒庫)；限制性內(nèi)切酶BbsⅠ、XbaⅠ和磷酸化酶FastAP (Fermentas公司)；連接酶Quick ligase(NEB公司)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒ViaFectTMTransfection Reagent (Promega公司)；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒和細(xì)胞基因組提取試劑盒(北京天根生物有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液(Thermo公司)；胎牛血清(Gemini公司)；T載體(TaKaRa公司)；Detecase內(nèi)切酶(上海吉?jiǎng)P基因公司)；高保真KOD FX DNA擴(kuò)增酶(Toyobo公司)。

1.2 方法

1.2.1 靶位點(diǎn)選擇及引物設(shè)計(jì)：運(yùn)用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-MLPA)對HEK293T細(xì)胞DMD基因進(jìn)行檢測，確認(rèn)是否完整。

選取DMD基因exon51兩端內(nèi)含子區(qū)域序列，應(yīng)用網(wǎng)站http://crispr. mit.edu/設(shè)計(jì)靶向sgRNA，每端選取3條分?jǐn)?shù)較高者用于質(zhì)粒構(gòu)建。靶點(diǎn)設(shè)計(jì)遵循以下原則: 1)G必須出現(xiàn)在sgRNA模版DNA序列5′ 端，若不是則合成時(shí)另添加1個(gè)G；2)盡量避開GC富集區(qū)域；3)選擇特異性位點(diǎn)。在正義鏈與反義鏈模板5′ 端分別添加CACC與AAAC，以分別與BbsⅠ酶切后形成的黏性末端互補(bǔ)。

應(yīng)用Genetool設(shè)計(jì)引物，上下游引物分別距離靶序列兩側(cè)翼100～150 bp，擴(kuò)增片段大小250～350 bp。將磷酸化的sgRNA雙鏈及上述引物交由上海生工生物有限公司合成。

1.2.2 PX459- sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建：質(zhì)粒載體系統(tǒng)(PX458/PX459)為化釀膿鏈球菌(S.Pyogenes)的CRISPR系統(tǒng)改造，靶向序列為20個(gè)堿基，下游PAM序列為NGG。其中PX458質(zhì)粒帶EGFP標(biāo)簽，PX459質(zhì)粒帶嘌呤霉素抗性基因。

37 ℃下使用核酸內(nèi)切酶BbsⅠ線性化PX459，蒸餾水重懸磷酸化的sgRNA雙鏈到終濃度并以1∶100稀釋，使用Quick ligase試劑以sgRNA：線性載體DNA為3～10∶1比例4 ℃連接過夜，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Stbl3感受態(tài)細(xì)胞后搖菌，部分菌液送測序，余置于-80 ℃保存。

1.2.3 細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：使用DMEM高糖培養(yǎng)基，10%胎牛血清，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前24 h，以5×105個(gè)細(xì)胞/孔均勻鋪至6孔板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)50%～60%匯合；使用ViaFectTMTransfection Reagent在6孔板中分別轉(zhuǎn)染5個(gè)重組質(zhì)粒，等量PX458為陰性對照，24 h后加入嘌呤霉素(puro，puromycin)至濃度1 g/L，3 d后維持低濃度puro(0.5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d后提取細(xì)胞基因組DNA。

1.2.4 Surveyor法檢測sgRNA切割效率：在PCR管中配置以下體系：DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2 ×PCR Mix 13 μL，ddH2O 8 μL。PCR程序：98 ℃ 3 min，30循環(huán)(98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min)，72 ℃ 10 min，98 ℃ 3 min。PCR擴(kuò)增后，自然冷卻至40 ℃以下，使得細(xì)胞內(nèi)的突變片段互相雜交而形成錯(cuò)配。在滅菌PCR管中配置以下體系：PCR產(chǎn)物2～3 μL，Detecase緩沖液2 μL，Detecase 1 μL，ddH2O 至10 μL。45 ℃反應(yīng)20 min后，立即在上述體系中加入2 μL stop緩沖液，進(jìn)行聚丙烯酰氨(PAGE)凝膠電泳并銀染，觀察條帶切割情況。

1.2.5 PX459- 雙sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建：PCR擴(kuò)增PX459- sgRNA5- 1質(zhì)粒中U6啟動(dòng)子及sgRNA5- 1序列，使用核酸內(nèi)切酶XbaⅠ處理后與同樣XbaⅠ線性化的PX459- sgRNA3- 1質(zhì)粒連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)Stbl3中，涂抹于含氨芐的LB平板上，挑單克隆，搖菌，小提質(zhì)粒后送測序驗(yàn)證，得到重組質(zhì)粒PX459- 2sgRNA5- 1+3- 1。

1.2.6 雙末端高效sgRNA共轉(zhuǎn)染切割外顯子：以細(xì)胞計(jì)數(shù)約為1×106個(gè)/孔將細(xì)胞均勻鋪至3個(gè)60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞達(dá)50%～60%匯合，A、B、C皿分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PX459- 2sgRNA5- 1+3- 1，PX459- 2sgRNA5- 1，PX458(陰性對照)。轉(zhuǎn)染24 h后，加入嘌呤霉素至濃度1 g/L，3 d后維持0.5 g/L puro繼續(xù)培養(yǎng)2代后保留部分細(xì)胞，余提取基因組DNA。

使用高保真KOD酶對3組細(xì)胞DMD基因exon51進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體并送測序。

2 結(jié)果

2.1 HEK293T細(xì)胞DMD基因檢測及靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

MLPA結(jié)果顯示DMD基因完整，無外顯子缺失或重復(fù)(圖1A)；在DMD基因exon51兩端靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原理及具體序列(圖1B)。

2.2 PX459質(zhì)粒信息及插入片段

將添加了黏性末端的靶向exon51兩端sgRNA分別命名為E51- 5- 1～3，E51- 3- 1～3(表1)，驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建的通用引物hU6-primer及測序引物序列(表2)。

2.3 PX459- sgRNA質(zhì)粒測結(jié)果及Surveyor分析

成功構(gòu)建含靶向DMD基因exon51 5′端sgRNA的重組質(zhì)粒2個(gè)，3′端3個(gè)(圖2)。Surveyor法顯示5個(gè)sgRNA均有切割活性，其中DMD- 5- 1和DMD- 3- 1活性最高(圖3)。

分組實(shí)驗(yàn)顯示DNA 2μg，Viafection 8μL時(shí)轉(zhuǎn)染效率可高達(dá)80%，且使用轉(zhuǎn)染試劑較少，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖4)。

2.4 PCR及T載體測序分析

對6株連接成功的菌落進(jìn)行測序，3株顯示DMD基因exon51敲除，敲除效率達(dá)50%；其中2株在連接處發(fā)生隨機(jī)插入，1株出現(xiàn)單個(gè)堿基缺失(圖5)。

A.the MLPA result of DMD gene of HEK293T cells, normal columns reached around the blue line and exceeded the red line; B.diagram of exon51 knock-out, the arrows pointed the target cleavage sites cut by Cas9 protein under the guidance of double sgRNAs; the introns around the cleavage sites connected through non-homologous end joining; the sequence of exon51 was highlighted and the sgRNAs sequence were bolded

圖1 MLPA檢測及靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)Fig 1 MLPA testing of DMD gene and target sites design

cohesive ends were represented by small letters.

表2 驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建及sgRNA活性的引物序列

The segments cut by Surveyor endonuclease were pointed by arrows, indicting DNA mismatch; the high-efficiency sgRNAs used in further experiments were circled圖3 sgRNA活性檢測Fig 3 Activity detection of sgRNAs

3 討論

DMD的基因治療研究中，以慢病毒為載體導(dǎo)入minidystrophin研究因機(jī)體免疫反應(yīng)在人體實(shí)驗(yàn)中失敗[8]；反義寡核苷酸介導(dǎo)的外顯子跳躍治療，長期療效也有待驗(yàn)證[9]?；蚓庉嬍切迯?fù)基因突變的最根本方法，可實(shí)現(xiàn)突變修復(fù)的穩(wěn)定傳遞，CRISPR/Cas9系統(tǒng)因簡單、高效、安全性高和毒性小等特點(diǎn)，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便被廣泛采用。在DMD基因編輯治療中，通過同源重組修復(fù)(homology-directed repair, HDR)插入缺失的外顯子或修復(fù)點(diǎn)突變可完成精準(zhǔn)的基因修復(fù)，但通常情況下HDR只存在于分裂細(xì)胞中；通過非同源重組修復(fù)(non-homologous endjoining, NHEJ)引入小的插入或缺失可修復(fù)讀碼框[10]，但效果并不明確；而BMD患者體內(nèi)可檢測出縮短dystrophin 蛋白突變體[2]，這本身已證明敲除特定外顯子用以治療DMD的可行性。突變熱點(diǎn)(如exon45- 55，exon51)的存在，使得設(shè)計(jì)1次sgRNA可用以多個(gè)患者，減少了臨床應(yīng)用成本。2015年已有研究使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對DMD患者成肌細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，隨后注射至DMD模型小鼠骨骼肌內(nèi)，檢測到正常的人dystrophin表達(dá)[11]。但如何提高切割及轉(zhuǎn)染效率，降低脫靶，尋找合適的細(xì)胞來源依然是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

A.two plamsids are located on 5′ terminal; B.three plasmids are located on 3′ terminal; red lines marked the insertion sequence of sgRNA

圖2PX459-sgRNA質(zhì)粒測序圖
Fig2SequencediagramofPX459-sgRNAplasmids

A.plasmids were transferred into cells by lipo2000; B, C, D.plasmids were transferred into cells by ViaFection; the top images were observed in white light and the bottom images were observed under fluorescence microscope

圖46孔板中質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T效果圖
Fig4Comparisonoftransfectionefficiencyamongdifferentconditions

A.control grope, the cleavage site of E51- 5- 1 is complete; B, C.two base(GG/GC) are random inserted between the two cleavage sites; D.one base A is random missing between the two cleavage sites

圖5T載體測序結(jié)果
Fig5ResultsofTvectorsequencing

多sgRNA載體的出現(xiàn)為大片段基因敲除提供了更為高效的工具。本研究中使用的PX459- 2sgRNA重組質(zhì)粒，同時(shí)將Cas9基因和雙sgRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞，與分次轉(zhuǎn)染相比大大提高了外顯子切割效率，降低了轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的毒性。Surveyor法是通過錯(cuò)配酶識(shí)別錯(cuò)配的雜合DNA雙鏈并剪切，電泳后將顯示出切割條帶。sgRNA引導(dǎo)Cas9內(nèi)切酶在特定位點(diǎn)進(jìn)行切割后，由于缺乏修復(fù)模板，DNA修復(fù)主要以NHEJ方式進(jìn)行，因此將靶序列擴(kuò)增后經(jīng)過變性、退火，將形成錯(cuò)配，電泳后切割條帶與未切割條帶的比例可反映出sgRNA活性。經(jīng)檢測，本研究外顯子切割成功率高達(dá)50%，而常規(guī)方法中單個(gè)位點(diǎn)切割也僅可達(dá)30%左右[11]。

相比于分離患者肌肉干細(xì)胞，iPSC來源廣泛，免疫排異反應(yīng)少，且具有成肌肉干細(xì)胞分化潛能和自我更新能力，最有可能為DMD患者提供長期有效治療[12- 13]。下一步實(shí)驗(yàn)中，將利用本研究建立的單質(zhì)粒CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除DMD基因exon51技術(shù)平臺(tái)，對DMD患者來源的iPSC進(jìn)行外顯子敲除，為DMD的機(jī)制和治療的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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