法尼醇X受體表達與胰腺癌患者預(yù)后及病理分期相關(guān)

王維斌， 董良博， 趙邦博， 盧 軍， 趙玉沛

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 基本外科， 北京 100730)

胰腺癌發(fā)病隱匿，進展迅速，早期診斷困難，目前仍然排在全世界癌相關(guān)死亡的第4位[1]。胰腺癌手術(shù)切除率為9%～36%，接受手術(shù)治療患者的5年生存率也只有19%～24%[2]。膽汁酸(bile acids, BAs)的主要生物學(xué)功能是在體內(nèi)乳化并溶解脂肪聚合物，是膽固醇在體內(nèi)的主要代謝途徑。法尼醇X受體(farnesoid X receptor, FXR)是BSA的關(guān)鍵核受體，調(diào)節(jié)BAs、脂類和糖代謝平衡，參與膽汁淤積、非酒精性脂肪肝、肝細胞再生、小腸細菌屏障生長和炎性腸病等疾病的發(fā)病機制[3- 4]。

近年來，諸多研究表明FXR與肝腺癌、肝膽管細胞癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、膽管癌的發(fā)生機制、化療敏感性和預(yù)后均有密切關(guān)系[5- 7]。但FXR在胰腺癌方面的相關(guān)研究較少。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人胰腺癌細胞系A(chǔ)sPC- 1、BxPC- 3、Capan- 1、Colo- 357、MIA PaCa- 2、Panc- 1、SU86.86和T3M4由本實驗室保存。收集2005年1月至2010年12月在北京協(xié)和醫(yī)院就診，并最終診斷為胰腺癌患者組織標本共50例和正常胰腺組織標本5名(全部患者均簽署知情同意書，本實驗獲得北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準)。胰腺癌患者年齡為45～78歲，平均57.5歲，其中男性26例、女性24例。

Real-time PCR試劑盒(Trizol Reagent)、TaqMan探針、RPMI 1640和 trypsin-EDTA(Invitrogen公司)； KAPA PROBE FAST qPCR Kits (Kapa Biosystems公司)；兔抗人FXR多克隆和鼠抗人GAPDH單克隆抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提和real-time PCR： 應(yīng)用Trizol reagent試劑盒，按照說明書抽提處于對數(shù)增殖期的8種胰腺癌細胞的總RNA，測定RNA濃度，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用Bio-Rad CFX96 real-time PCR系統(tǒng)進行實時定量PCR，循環(huán)擴增條件：95 ℃、10 min變性，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。FXR引物：上游引物5′-AGAAACAGTGTCCGTAGAGC-3′，下游引物5′-GCAG ACCACACACAGCTCAT-3′。

1.2.2 Western blot：大量收集6孔板中處于對數(shù)增殖期的8種胰腺癌細胞，應(yīng)用細胞裂解液提取細胞總蛋白。加兔抗人FXR多克隆抗體在4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜,羊抗兔IgG抗體在室溫下孵育1 h，兔抗人FXR多克隆抗體按照1∶500稀釋應(yīng)用，鼠抗人GAPDH單克隆抗體按1∶5 000稀釋應(yīng)用。

1.2.3 免疫組化染色及評分系統(tǒng)：兔抗人FXR多克隆抗體按照1∶200進行稀釋應(yīng)用，免疫組化具體實驗步驟如前所述[8]。邀請兩位病理科醫(yī)生獨立分別針對FXR染色的強度及范圍進行評分。染色強度評分情況如下，無染色：0分；弱：1分； 中度：2分；高度：3分。染色范圍評分情況如下，<5%：0分；5%～25%：1分；>25%～50%：2分；≥50%～75%：3分；>75%：4分。然后，取兩者的乘積得到最終總評分，并按照分數(shù)高低將樣本分為FXR低度表達組 (<4分)和FXR高度表達組 (≥4分)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FXR在胰腺癌8種細胞中的mRNA和蛋白表達水平

FXR蛋白在胰腺癌細胞中普遍表達，其中在Canpan- 1和T3M4中高度表達，而在MiaPaCa- 2和Panc- 1細胞中相對表達較低，與real-time PCR結(jié)果相似(圖1)。

A.Western blot results showed that FXR protein was highly expressed in pancreatic cancer cells Canpan- 1 and T3M4, while in MiaPaCa- 2 and Panc- 1 cells, FXR was lowly expressed; B.real-time PCR results showed that FXR mRNA was also highly expressed in pancreatic cancer cells Canpan- 1 and T3M4, and was lowly expressed in MiaPaCa- 2 and Panc- 1 cells, accordant with Western blot results;*P<0.05,**P<0.01 compared with Aspc1 mRNA expression

圖1應(yīng)用Westernblot和real-timePCR方法檢測FXR在8株胰腺癌細胞中的蛋白及mRNA表達水平

2.2 檢測FXR在正常胰腺組織和胰腺癌組織中的蛋白表達水平

FXR在正常胰腺組織中普遍表達水平較低(圖2A)，而在胰腺癌細胞中呈不同程度的胞質(zhì)和細胞核高表達(圖2B～D)。FXR在胰腺胰島細胞中亦呈普遍高表達(圖2E)，F(xiàn)XR在胰腺神經(jīng)組織內(nèi)表達陰性(圖2F)。

2.3 FXR蛋白表達水平與胰腺癌患者的病理G分期及生存時間密切相關(guān)

FXR的蛋白表達水平與患者病理G分期密切相關(guān)(P<0.05)，即病理分化差的G3期胰腺癌組織中，F(xiàn)XR蛋白表達水平相對較低。FXR蛋白表達水平與病理G分期均為胰腺癌患者預(yù)后的獨立因素(P<0.05)。胰腺癌FXR高表達患者的生存時間明顯長于FXR低表達患者(P<0.05)(圖3和表1)。

3 討論

FXR是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族成員之一，在體內(nèi)主要負責(zé)膽汁酸的代謝平衡穩(wěn)定，本文重點討論FXR在腫瘤發(fā)生、發(fā)展機制方面的生物學(xué)功能。FXR可以抑制腫瘤細胞的增殖，并且促進腫瘤細胞向正常細胞轉(zhuǎn)化，F(xiàn)XR通過下調(diào)EGFR磷酸化和ERK活性來抑制小腸上皮細胞增殖和腫瘤的發(fā)生[9]。應(yīng)用法尼醇直接刺激胰腺癌BxPC3細胞，可以顯著誘導(dǎo)胰腺癌細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，同時伴隨凋亡相關(guān)Bak基因表達上調(diào)[10]。FXR的表達水平與胰腺癌細胞的侵襲性呈負相關(guān)，即對腫瘤細胞發(fā)揮抑制作用[11]。FXR在結(jié)腸癌組織中低度表達，而在癌旁組織中的表達水平相對較高，與結(jié)腸癌患者的生存時間呈正相關(guān)[12]。

A.localization of FXR in plasmalemma and cell nucleus of normal pancreatic duct cells showed negative staining; B.weak expression of FXR in pancreatic cancer cells; C.moderate expression of FXR in pancreatic cancer cells; D.strong experssion of FXR in pancreatic cancer cells; E.moderate expression of FXR in pancreatic islet cells; F.no staining in pancreatic nerves; immunohistochemistry was performed with FXR(1∶200)

圖2免疫組化方法檢測FXR在正常胰腺組織和胰腺癌組織中的定位與蛋白表達

Fig2FXRlocationandexpressioninnormalpancreatictissuesandpancreaticcancertissueswithIHCs(×50)

A.survival time of pancreatic cancer patients with high FXR expression was obviousely longer than those patients survival time with low FXR expression, FXR expression was closely positive related with survival time of pancreatic cancer patients(P<0.05); B.survival time of pancreatic cancer patients with pathological grade G1/G2 was apparently longer than those patients with pathological grade G3(P<0.05)

圖3Kaplan-Meier和log-rank方法對預(yù)后因素應(yīng)用COX比例風(fēng)險回歸模型進行多因素分析

Fig3Kaplan-Meierandlog-rankanalysesofprognosticfactorsassessedinamultivariableanalysisusingaCoxproportionalhazardsmodel

FXR表達上調(diào)可以明顯抑制肝癌細胞在裸鼠體內(nèi)的增殖速度[13]。本實驗結(jié)果與報道完全一致，F(xiàn)XR的表達水平與胰腺癌病理G分期密切相關(guān)，而且與胰腺癌患者的生存時間呈顯著性正相關(guān)，是胰腺癌患者的獨立預(yù)后因素。

亦有研究報道在其他腫瘤中，F(xiàn)XR卻發(fā)揮著相反的生物學(xué)功能，F(xiàn)XR在乳腺癌細胞及組織中高表達，可以促進乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及通過與雌激素受體(estrogen receptor, ER)的相互作用促進腫瘤細胞增殖[14]； FXR在食管癌細胞中高度表達，并且與腫瘤的病理分化程度差、腫瘤體積大和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著性正相關(guān)[15]。

表1 FXR表達水平與患者臨床資料的相關(guān)性分析

*P<0.05 compared with normal pancreatic tissue.

綜上，諸多研究證明FXR確實在不同類型腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制中均發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能，其作用機制尚不清楚。而且，膽汁酸在體內(nèi)代謝除了熟知的核受體FXR，還有膜受體TGF5(G protein-coupled receptor，TGR5)，同樣發(fā)揮著紛繁復(fù)雜的生物學(xué)功能，需要進一步地深入研究和探索。

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新聞點擊

頭痛可以怪罪甲狀腺問題

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 10- 10)報道，新近研究指出，有偏頭痛或其他頭痛問題的人罹患甲狀腺功能低下的風(fēng)險較高。

當身體無法產(chǎn)生足夠甲狀腺激素時，就會發(fā)生甲狀腺功能低下，根據(jù)辛辛那提大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員指出，這會造成情緒波動、體質(zhì)量增加、掉發(fā)、疲勞、便秘、以及月經(jīng)周期不規(guī)律等問題。

調(diào)查人員發(fā)現(xiàn)，有類似叢集性頭痛或緊張性頭痛等原發(fā)性頭痛者，甲狀腺功能低下的風(fēng)險高了21%；可能有偏頭痛的人風(fēng)險高了41%。

研究結(jié)果顯示，有偏頭痛的人特別容易有甲狀腺機能低下是什么讓頭痛與甲狀腺機能低下有關(guān)，尚不清楚。

這篇研究刊登在2016- 09- 27《頭痛：頭部與臉部疼痛》。

兒童時期創(chuàng)傷導(dǎo)致早衰

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 10- 13)報道，新近研究指出，兒童時期的創(chuàng)傷可能促使細胞老化速度加快。

加拿大溫哥華英國哥倫比亞大學(xué)健康老化與壓力實驗室主任Eli Puterman認為，孩童時曾經(jīng)歷過壓力的成人似乎其染色體尾端的端粒變短的風(fēng)險增加，這可能會增加生病以及成人時期早死的風(fēng)險。

Puterman主任強調(diào)，細胞老化比較快是相對的。這只代表風(fēng)險有增加。并不是每個幼年時期曾有創(chuàng)傷的人每個人都會在晚年以生病終了。

Puterman解釋，端粒就像是鞋帶兩端的塑料頭，它可以避免鞋帶磨損。在這個案例中，端粒可避免人類染色體散開，防止細胞比較快老化與死亡。

Puterman與同事們評估了近4 600例以后發(fā)現(xiàn)，幼兒時期每經(jīng)歷一件明顯有壓力的事情，可能使端粒變短的風(fēng)險增加11%。

根據(jù)報告指出，有壓力的事情包括父母親吸毒或酗酒、虐待、違法、留級、或是家中經(jīng)濟困難。

沒有人能完全解釋這個原因，但Puterman認為，這可能是因為戰(zhàn)斗或逃跑激素在有大量壓力產(chǎn)生時釋放，這些激素會磨損免疫系統(tǒng)，因此它不是立刻就磨損人的細胞與染色體。

這些研究結(jié)果刊登在2016- 10- 03《美國科學(xué)院院報》。