大鼠中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)腹外側(cè)區(qū)GABAAα1表達(dá)上調(diào)與甲醛致急性疼痛有關(guān)

孫萬(wàn)秋，王桂芝*，婁 超，張春燕，冀玉萍，李 軍，于劍鋒

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)系， 山東 濰坊 261053； 2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 麻醉科， 山東 泰安 271000；3.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 麻醉科，山東 濰坊 261031)

γ-氨基丁酸A(γ-aminobutyric acid A，GABAA)受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性離子型受體，包含19種亞型：α1- 6、β1- 4、δ、γ1- 4、ρ1- 3、ε。早期研究表明γ-氨基丁酸A受體α1亞基(γ-aminobutyric acid A receptor α1 subunit，GABAAα1)主要分布在中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)腹外側(cè)區(qū)(ventrolateral periaqueductal gray，vLPAG)神經(jīng)元的胞體和突起[1]，而vLPAG是內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的重要組成部分，在疼痛傳遞與調(diào)節(jié)中處于承上啟下的關(guān)鍵部位[2]，其外側(cè)區(qū)是鎮(zhèn)痛最有效的部位，因此越來(lái)越多的疼痛機(jī)制的研究集中于vLPAG與GABAA受體之間關(guān)系。近期研究表明，在神經(jīng)病理性疼痛大鼠vLPAG植入刺激電極進(jìn)行深部腦組織刺激有較好的鎮(zhèn)痛作用[3]，GABAA受體還可作為新型鎮(zhèn)痛藥作用于脊髓疼痛通路的靶點(diǎn)[4]，但是GABAA受體在vLPAG處疼痛調(diào)節(jié)的具體機(jī)制還不明確。本研究旨在探討大鼠中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)腹外側(cè)區(qū)GABAAα1在急性疼痛時(shí)的表達(dá)變化，為探究急性疼痛的調(diào)節(jié)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：兔抗大鼠GAPDH和山羊抗兔IgG(Wanleibio公司)，兔抗大鼠GABAAα1抗體(AbSci公司)。

1.1.2 動(dòng)物：清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量240～280 g[ 濟(jì)南朗悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司；合格證號(hào)：SCXK(魯)20140007 ]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和處理方法均符合濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)要求。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(control組，C組，n=12)和甲醛致痛組(formalin組，F(xiàn)組，n=12)：于右側(cè)后足底注射0.9%氯化鈉溶液和2%甲醛各50 μL，1 h內(nèi)記錄所需數(shù)據(jù)。

1.2.2 大鼠機(jī)械痛閾的測(cè)定：室溫下，將大鼠置于底面為細(xì)孔鐵絲網(wǎng)的有機(jī)透明玻璃箱中，在鐵絲網(wǎng)底以45°夾角放置一面鏡子，以便觀察動(dòng)物后肢的活動(dòng)情況。用不同壓力的vonFrey細(xì)絲通過(guò)鐵絲網(wǎng)孔刺激其注射足底。按照文獻(xiàn)[5]方法測(cè)定機(jī)械痛閾的有效壓力值。

1.2.3 大鼠疼痛學(xué)評(píng)分：甲醛致急性疼痛大鼠行為學(xué)改變主要在甲醛刺激后1 h內(nèi)，呈兩相變化。采用兩時(shí)相縮足及舔爪時(shí)間之和作為疼痛學(xué)指標(biāo)[6]，即大鼠足底注射甲醛后立即記錄大鼠1 h內(nèi)每5 min的縮足舔爪時(shí)間，并分別統(tǒng)計(jì)兩時(shí)相縮足舔爪時(shí)間之和。

1.2.4 Western blot檢測(cè)GABAAα1受體蛋白表達(dá)：測(cè)定記錄結(jié)束后，腹腔注射20%水合氯醛(0.2 mL/100 g)進(jìn)行麻醉，開(kāi)胸暴露心臟，左心室灌注沖洗，迅速斷頭處死大鼠，分離出完整大腦，參照第6版大鼠腦立體定位圖譜，切取并提取vLPAG處蛋白，以上操作均在4 ℃下進(jìn)行。以BCA法測(cè)定總蛋白濃度，電泳分離，以PVDF膜轉(zhuǎn)移蛋白條帶，封閉液室溫封閉2 h，分別加兔抗大鼠GABAAα1一抗溶液(1∶1 000)和抗大鼠GAPDH(1∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜后，再加HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗溶液(1∶3 000)室溫孵育2 h，利用天能5200發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)顯影并留取圖像，采用IPP 6.0分析圖像獲取相應(yīng)吸光度值，以吸光度比值反映GABAAα1的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠疼痛行為學(xué)評(píng)分

F組大鼠有縮足舔爪等疼痛行為學(xué)反應(yīng)，呈明顯的兩相性，各組第1、2時(shí)相行為學(xué)比較見(jiàn)表1。第1、2時(shí)相內(nèi)C組大鼠出現(xiàn)縮足舔爪反應(yīng)較少，F(xiàn)組大鼠的縮足舔爪時(shí)間明顯增多(P<0.05)。

表1 兩組大鼠疼痛行為學(xué)評(píng)分1、2時(shí)相變化

*P<0.05 compared with group control.

2.2 大鼠機(jī)械痛閾改變

與C組大鼠相比，F(xiàn)組大鼠在注射后10 min時(shí)機(jī)械痛閾值開(kāi)始顯著降低(P<0.05)，在注射后10～60 min內(nèi)機(jī)械痛閾值顯著降低(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with group control圖1 兩組大鼠機(jī)械痛閾變化Fig 1 Changes of mechanical pain threshold in two

2.3 GABAAα1表達(dá)量的變化

F組GABAAα1蛋白相對(duì)表達(dá)量為1.28±0.40，C組為0.39±0.09，F(xiàn)組表達(dá)量明顯高于C組(P<0.05)(圖2)。

圖2 兩組大鼠GABAAα1受體蛋白表達(dá)量的比較Fig 2 Comparison of GABAAα1 receptor expression in two groups of rats

3 討論

甲醛致痛是模擬臨床急、慢性炎性痛的良好模型，普遍用于疼痛機(jī)制研究及鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)。本研究大鼠足底注射甲醛后1 h內(nèi)，疼痛行為學(xué)評(píng)分持續(xù)升高，機(jī)械痛閾持續(xù)降低，且疼痛行為學(xué)改變呈兩

相性：第1時(shí)相為自發(fā)縮足反應(yīng)期，注射后即出現(xiàn)持續(xù)約5 min，是外周傷害性感受器受甲醛刺激所致；兩相之間是相對(duì)靜默的沉默期，持續(xù)約10 min；第2時(shí)相為持續(xù)疼痛期，注射后約15～60 min出現(xiàn)，其機(jī)制是炎性反應(yīng)[7]。

中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)(PAG)是上行痛覺(jué)傳導(dǎo)及下行痛覺(jué)調(diào)節(jié)的重要組成部分，vLPAG有較多的神經(jīng)纖維投射至中縫大核、延髓頭端腹外側(cè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、巨細(xì)胞旁核外側(cè)和脊髓等與痛覺(jué)調(diào)節(jié)有關(guān)的核團(tuán)[8]。起源或中繼于PAG和延髓頭端腹外側(cè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的下行內(nèi)源性痛覺(jué)抑制系統(tǒng)受GABA能神經(jīng)元的緊張性抑制，并以GABAA受體分布為主[9]，表明vLPAG處GABAA受體可能參與疼痛調(diào)控。

在GABAA受體復(fù)合物的組裝及功能中GABAA受體α亞基(GABAAα)可能起主要作用[10]，且在各種疼痛的形成和調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[11- 12]；本課題組前期研究表明，大鼠急性疼痛條件下痛閾降低可導(dǎo)致vLPAG處GABAAα3的表達(dá)上調(diào)[5]，但GABAAα1受體的改變趨勢(shì)仍有待研究。本研究建立大鼠急性疼痛模型后1 h檢測(cè)到vLPAG處GABAAα1蛋白表達(dá)上調(diào)，可推測(cè)GABAAα1受體也是參與vLPAG對(duì)急性疼痛傳導(dǎo)調(diào)節(jié)的分子基礎(chǔ)。

綜上所述，大鼠在急性疼痛條件下痛閾降低可導(dǎo)致vLPAG處GABAAα1蛋白表達(dá)增加，提示大鼠vLPAG處腦組織GABAAα1表達(dá)上調(diào)與甲醛致急性疼痛有關(guān)，但該受體參與急性疼痛傳導(dǎo)調(diào)節(jié)的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳濤，董元祥. 大鼠中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)和中縫背核內(nèi)GABAA受體α1、α2、β亞型和GABAB受體的定位分布[J]. 中華國(guó)際醫(yī)學(xué)雜志, 2002, 2:30- 33.

[2] 賈志華，于生元. 中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)參與疼痛發(fā)病機(jī)制的磁共振研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 22: 454- 457.

[3] 王寧，張婷，蘇園林，等. 中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)電刺激與丘腦電刺激對(duì)大鼠傷害感知行為的差異調(diào)節(jié)(英文)[J]. 生理學(xué)報(bào), 2016, 68: 115- 125.

[4] Zeilhofer HU, Ralvenius WT, Acuna MA. Restoring the spinal pain gate: GABA(A) receptors as targets for novel analgesics[J]. Adv Pharmacol, 2015, 73: 71- 96.

[5] 婁超，王桂芝，于劍鋒，等. 中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)腹外側(cè)區(qū)GABAAα3及GABAB受體在調(diào)節(jié)急性疼痛中的作用[J]. 臨床麻醉學(xué)雜志, 2017, 33: 488- 491.

[6] Abbott FV, Franklin KB, Westbrook RF. The formalin test: scoring properties of the first and second phases of the pain response in rats[J]. Pain, 1995, 60: 91- 102.

[7] Mccall WD, Tanner KD, Levine JD. Formalin induces biphasic activity in C-fibers in the rat[J]. Neurosci Lett,1996, 208: 45- 48.

[8] Cameron AA, Khan IA, Westlund KN,etal. The efferent projections of the periaqueductal gray in the rat: a Phaseolus vulgaris-leucoagglutinin study. II. Descending projections[J]. J Comp Neurol, 1995, 351: 585- 601.

[9] Chu DC, Albin RL, Young AB,etal. Distribution and kinetics of GABAB binding sites in rat central nervous system: a quantitative autoradiographic study[J]. Neuroscience, 1990, 34: 341- 357.

[10] Hortnagl H, Tasan RO, Wieselthaler A,etal. Patterns of mRNA and protein expression for 12 GABAA receptor subunits in the mouse brain[J]. Neuroscience, 2013, 236: 345- 372.

[11] 范袆，楊曉蘇，郭一航，等. γ-氨基丁酸A受體α1亞基信使核糖核酸在硝酸甘油偏頭痛大鼠模型腦干及三叉神經(jīng)組織中的表達(dá)變化[J]. 中華神經(jīng)科雜志, 2013, 46: 479- 482.

[12] Bravo-Hernandez M, Corleto JA, Barragan-Iglesias P,etal. The alpha5 subunit containing GABAA receptors contribute to chronic pain[J]. Pain, 2016, 157: 613- 626.

新聞點(diǎn)擊

孕吐是一件好事

據(jù)美國(guó)WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 10- 06)報(bào)道，最新研究顯示，雖然孕吐讓你在懷孕初期很痛苦，但它是你的胎兒健康、正常的征兆。

研究人員在說(shuō)明背景資料時(shí)指出，有4/5的婦女在懷孕期間會(huì)有惡心或嘔吐的情況。

專(zhuān)家解釋?zhuān)型伦畛０l(fā)生的原因是因?yàn)閯倯言械膵D女體內(nèi)激素量改變，尤其是懷孕激素，也就是人絨毛膜促性腺激素(HCG) 的含量。懷孕激素含量越高，女性就越容易有嘔吐或惡心的癥狀。

這篇研究評(píng)估的對(duì)象是那些已經(jīng)流產(chǎn)過(guò)1～2次的婦女，研究結(jié)果顯示，那些曾忍受早上惡心、嘔吐的孕婦流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)可能減少50%～75%。

研究人員們推測(cè)，惡心與嘔吐可能代表能發(fā)育的胎盤(pán)組織，換句話(huà)說(shuō)，沒(méi)有釋放足夠荷爾蒙的胎盤(pán)組織可能不會(huì)讓孕婦不舒服，也代表可能是有問(wèn)題的。

然而，專(zhuān)家們一致認(rèn)為，沒(méi)有孕吐的婦女不應(yīng)該自己假設(shè)懷孕過(guò)程有問(wèn)題，因?yàn)槊總€(gè)人、每次懷孕的情況都不相同。

研究人員表示，雖然孕吐可見(jiàn)少流產(chǎn)的這種主張已經(jīng)出現(xiàn)好長(zhǎng)一段時(shí)間，但他們的數(shù)據(jù)是至今最可靠的證據(jù)，不過(guò)，這篇研究并不能證明其因果關(guān)系。

研究結(jié)果刊登在2016- 09- 26《JAMA內(nèi)科學(xué)》。