miR-143靶向調(diào)控ER-α36影響胃癌細胞系SGC7901的侵襲

鄒 豐, 羅媛媛，劉麗江*

(江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 1.病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室； 2.醫(yī)療系， 湖北 武漢 430056)

雌激素受體ER-α36(estrogen receptor-α36)作為近幾年鑒定并克隆出的一種新型的雌激素受體，發(fā)揮著與經(jīng)典的雌激素受體ER-α66完全不同的生物學(xué)功能[1]。ER-α36啟動雌激素樣信號傳導(dǎo)主要通過細胞膜來完成，不僅能夠調(diào)控乳腺癌等性激素依賴性腫瘤的生長[2]，也能介導(dǎo)胃癌等非性激素依賴性腫瘤的發(fā)生[3]。

microRNA是一類長度約為20～25 nt的小分子

單鏈RNA，具有高度保守的內(nèi)源性非蛋白編碼，其主要功能是通過對靶基因轉(zhuǎn)錄體的切割或翻譯抑制來調(diào)控基因的表達[4]。前期研究證實，雌激素受體ER-α36不僅能在胃癌組織和胃癌細胞系中表達，也能促進胃癌細胞的侵襲，其機制可能與microRNA- 143(miR-143)有關(guān)[5]。本項研究將進一步用體外實驗闡明miR-143通過靶向ER-α36調(diào)控胃癌細胞的侵襲。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人胃癌細胞系SGC7901(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系惠贈，為本實驗室保存)。

1.1.2 試劑:ER-α36沉默質(zhì)粒、ER-α36過表達質(zhì)粒和ER-α36單克隆抗體(美國Creighton大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤中心王兆一教授饋贈)；β-Actin抗體(Santa Cruz公司)；Transwell侵襲試劑盒(Millipore公司)；miR-143、內(nèi)參U6的Taqman引物和探針(Applied Biosystems公司)；質(zhì)粒抽提試劑盒和Dual-GloTMLuciferase Assay System(Promega公司)；Opti-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組處理：將人胃癌SGC7901細胞接種在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d待細胞增殖至70%～80%匯合時胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建：通過使用miRNA 抑制劑克隆導(dǎo)入細胞后表達miRNA抑制劑(miArrest) 和插入pre-miR143序列的方法構(gòu)建miR-143沉默和miR-143表達的質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測序驗證。其目的載體選用GV159和GV272。慢病毒載體(lentiviral vectors,LV)系統(tǒng)由 GV 慢病毒載體系列、pHelper 1.0 載體和 pHelper 2.0 載體3質(zhì)粒組成并包裝生成上調(diào)/下調(diào)miR-143的慢病毒LV-miR-143和LV-anti-miR-143。用慢病毒的方法感染人胃癌SGC7901細胞系，熒光顯微鏡下觀察EGFP熒光蛋白的變化。

1.2.3 Western blot檢測ER-α36蛋白的表達：提取細胞胞質(zhì)總蛋白。按BCA蛋白含量測定試劑盒說明進行蛋白定量，經(jīng)SDS-PAGE分離后蛋白半干轉(zhuǎn)印于PVDF膜，封閉后I抗分開孵育：分別加入ER-α36抗體和β-actin抗體，4 ℃過夜；洗膜后孵育II抗，室溫1 h，洗膜后于暗室中行ECL顯色檢測蛋白的表達，采用數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描測定ER-α36和內(nèi)參β-actin的表達(用平均吸光度值表示)。

1.2.4 Transwell小室實驗檢測SGC7901細胞的侵襲：采用Millpore試劑盒，按說明書操作。

1.2.5 生物信息學(xué)配對：利用microRNA的靶基因數(shù)據(jù)庫(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)進行ER-α36基因的3′UTR區(qū)與miR-143的Seed Region(種子區(qū))的配對分析。

1.2.6 熒光素酶檢測ER-α36和miR-143的相關(guān)性：培養(yǎng)增殖狀態(tài)良好的293T細胞，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前1 d，將細胞分入24-well培養(yǎng)板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染當(dāng)天按實驗設(shè)計的組別進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)熒光標記基因(如GFP)的表達情況，然后使用試劑盒處理細胞，進行l(wèi)uciferase表達檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白EGFP的表達

轉(zhuǎn)染后miR-143 down組細胞和miR-143 up組細胞均能發(fā)出大量綠色熒光，且細胞情況良好，輪廓邊緣清晰。對照組無熒光信號的產(chǎn)生(圖1)。

2.2 沉默或過表達miR-143對SGC7901細胞ER-α36表達的影響

miR-143沉默組(miR-143 down)其ER-α36蛋白表達要明顯高于對照組(P<0.05)；miR-143表達組(miR-143 up)其ER-α36蛋白表達要明顯低于對照組和miR-143表達組(miR-143 up)(P<0.05)(圖2)。

2.3 沉默或過表達miR-143對SGC7901細胞侵襲性的影響

與對照組細胞相比，miR-143沉默(miR-143 down)的侵襲性明顯增強，而miR-143表達的質(zhì)粒(miR-143 up)的侵襲性明顯減弱(圖3)。

2.4 miR-143與ER-α36的配對

ER-α36基因的3′UTR區(qū)與miR-143的Seed Region(種子區(qū))有超過14對的堿基互補，可能成為miR-143的重要靶基因之一(圖4)。

圖1 慢病毒感染24 h細胞感染率Fig 1 Cell infection rate (24 hours after transfection, ×200)

*P<0.05 compared with CON group

圖3 過表達miR-143抑制SGC7901細胞的侵襲，反之增加

圖4 miR-143的種子區(qū)與ER-α36的3′端非編碼區(qū)有14對堿基互補配對Fig 4 14 direct recognitions of the 3′-UTR of the mRNA of ER-α36 by miR-143

2.5 熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CER-α36和miR-143的關(guān)系

在野生型(WT cell)中，轉(zhuǎn)染miR-143 表達組(miR-143 up)的熒光素酶表達量比轉(zhuǎn)染對照類似物組明顯下降(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-143沉默組(miR-143 down)的熒光素酶表達量明顯上升(P<0.05)；對ER-α36 3′UTR區(qū)的相應(yīng)位點進行突變后的miR-143(MUT cell)不再影響熒光素酶的表達量。即證實miR-143可以直接與ER-α36 3′UTR區(qū)的特定位點以堿基互補配對方式結(jié)合，其序列在種屬間高度保守，且其相互作用的親和力較高(圖5)。

*P<0.05 compared with miR-143 up NC group; #P<0.05 compared with miR-143 down NC group圖5 熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-143負向調(diào)控ER-α36的表達Fig 5 Luciferase reporter assay confirmed the direct recognition of the 3′-UTR of ER-α36 by

3 討論

探討胃癌防治的分子機制具有重要的臨床意義。MicroRNA是一類具有高度保守的內(nèi)源性非蛋白編碼的小分子單鏈RNA，其與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密不可分。前期研究工作發(fā)現(xiàn)：低濃度的雌激素促進胃癌細胞的侵襲，高濃度的雌激素抑制胃癌細胞的侵襲。胃癌的侵襲能力和雌激素受體ER-α36的表達呈正相關(guān)，其機制可能與miR-143的調(diào)控有關(guān)。

miR-143位于人類基因組5號染色體上，在多種生物中均有表達。miR-143最早被報道存在于小鼠胚胎的多能心臟祖細胞中，其功能是促進平滑肌細胞的分化并抑制其增生[6]。最近已有大量的證據(jù)顯示miR-143與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。miR-143表達的下調(diào)可以促進食管鱗狀細胞癌的發(fā)生[7]。miR-143還能通過調(diào)控其靶基因DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A蛋白來介導(dǎo)結(jié)直腸癌的發(fā)生[8]。miR-143與胃癌的發(fā)生也聯(lián)系緊密。應(yīng)用miRNAs芯片技術(shù)篩選了47例配對的胃癌和正常胃組織，對比差異發(fā)現(xiàn)有42個miRNA高表達，20個miRNA低表達。其中差異最顯著的是miR-143[9]。通過胃癌組織和癌旁正常組織與SGC7901胃癌細胞的對比發(fā)現(xiàn)，miR-143可通過抑制鳥成紅細胞增多癌基因- 3(ERBB3)的表達抑制胃癌細胞的增殖與遷移[10]。雖然不同的研究者針對的靶向調(diào)控基因不同，但與本研究結(jié)果一致的是，miR-143都參與了抑制胃癌的發(fā)生，提示miR-143有一定的分子靶向治療前景。

miR-143的水平也會隨著胃癌的發(fā)展過程發(fā)生顯著的改變。82例晚期接受含紫杉醇聯(lián)合鉑類或氟尿嘧啶類藥物的胃癌患者的血清標本中miR-143的水平與同期76名健康體檢者的miR-143水平相比后顯著降低，提示晚期胃癌血清miR-143水平明顯低于正常值，且與含紫杉醇方案化療敏感性及預(yù)后均有關(guān)[11]。推測出miR-143的水平改變對于腫瘤的評估已有一定的臨床意義。此外，另一種非編碼RNA的lncRNA在胃癌中的研究愈來愈熱[12]。LncRNA還能與miRNA相互調(diào)節(jié)來促進或抑制腫瘤的發(fā)生[13]。因此，下一階段還會對在胃癌中表達差異的lncRNA進行相關(guān)研究，并探討與miRNA尤其是miR-143之間的關(guān)聯(lián)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示：miR-143通過靶向雌激素受體ER-α36負向調(diào)控胃癌細胞SGC7901的侵襲。

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乳房哺乳結(jié)束后會啟動自毀程序

據(jù)英國《BBC新聞》(BBCNEWS)2016年10月15日報道，當(dāng)母乳哺喂停止時，這個“乳汁工廠”會在幾天內(nèi)停工。但是乳房如何在短時間內(nèi)迅速的從人奶制造機回復(fù)到原先的自然狀態(tài)，新近科學(xué)家確定了一個控制泌乳細胞轉(zhuǎn)變成為垂死細胞吞噬者的分子開關(guān)，終于揭開了其中的秘密。

在懷孕期間，女性體內(nèi)的激素變化會引起乳房上皮細胞襯里的腺管增殖，形成名為乳腺泡(alveolus)的球狀結(jié)構(gòu)，制造并儲存奶水。然而，一旦婦女停止母乳喂養(yǎng)，這些結(jié)構(gòu)以牽涉到大規(guī)模細胞自殺并除去碎屑的方式自毀。

有趣與神秘之處在于：已知人體的免疫細胞會進行吞噬作用(phagocytosis)清除死亡和垂死細胞，過程中由于消耗的物質(zhì)數(shù)量龐大，因此會產(chǎn)生炎性反應(yīng)-明顯的腫脹、疼痛和組織損傷；但這些現(xiàn)象在女性停止哺乳時通常不會發(fā)生。澳洲悉尼大學(xué)的癌生物學(xué)家Matthew Naylor指出，這是當(dāng)今科學(xué)家對于女性停止哺乳后的乳房轉(zhuǎn)變過程特別無法理解的部分；在停止哺乳后，剩余的乳汁與大量的死亡細胞如何不經(jīng)歷上述免疫系統(tǒng)運作時會發(fā)生的實質(zhì)反應(yīng)而被從乳腺中移除？由于已知一種名為Rac1的蛋白質(zhì)對于正常制造奶水，以及免疫細胞行吞噬作用兩者來說都至關(guān)重要，因此，英國Sheffield大學(xué)的學(xué)者Nasreen Akhtar與其同事認為Rac1可能也在哺乳停止后的乳房重塑過程扮演重要角色。為此，他們使用雌性小鼠進行實驗。

監(jiān)督此研究的學(xué)者Charles Streuli指出，在停止哺乳后，必須被迅速從乳腺清除的物質(zhì)量非常巨大，如果光仰賴免疫細胞吞噬死亡細胞，仍然會獲得慢性炎性反應(yīng)和組織損傷；而根據(jù)Akhtar的研究結(jié)果，首次顯示了Rac1是吞噬細胞活性的關(guān)鍵，且停止哺乳后，細胞尸體與剩余乳汁的凈空對組織功能的長期發(fā)展至關(guān)重要。

除了觸發(fā)吞噬功能，Rac1似乎也讓瀕死細胞在乳腺泡里停留更長的時間，目的可能是鼓勵它們的鄰居吞沒它們，而不是把它們留給在乳腺導(dǎo)管中的免疫細胞。Streuli認為：由此，乳腺管內(nèi)的上皮細胞得以進行清理自己的工作，進而牽制住會引起炎性反應(yīng)的吞噬細胞。