5-羥色胺2C受體對(duì)形覺(jué)剝奪性成年弱視大鼠離體腦片初級(jí)視皮層長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的影響

王嬌嬌，劉向玲，路承彪，宋子宣，張 銳，張 地

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院眼科，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.運(yùn)城市眼科醫(yī)院眼科，山西 運(yùn)城 044000)

視覺(jué)發(fā)育敏感期內(nèi)不正常的形覺(jué)體驗(yàn)所造成的視力障礙稱為弱視[1]，臨床上對(duì)于成人弱視的治療存在爭(zhēng)議，其治療效果也不理想。研究發(fā)現(xiàn)，成年弱視大鼠長(zhǎng)期應(yīng)用氟西汀可明顯逆轉(zhuǎn)眼優(yōu)勢(shì)柱的轉(zhuǎn)移，并促進(jìn)視功能的恢復(fù)，但其作用機(jī)制尚不明確[2-3]。而5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)作為神經(jīng)遞質(zhì)，需與相應(yīng)受體結(jié)合才能調(diào)節(jié)突觸可塑性[4]。有研究顯示，5-羥色胺2C受體(5-hydroxytryptamine-2C subunit receptor，5-HT2CR)在斜視性弱視貓視皮層中的表達(dá)較正常貓明顯下降[5]。但關(guān)于單眼形覺(jué)剝奪成年弱視大鼠視皮層中5-HT2CR有何改變，目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本研究擬用電生理學(xué)方法探討5-羥色胺鹽酸鹽和5-HT2CR拮抗劑SB 242084對(duì)單眼形覺(jué)剝奪成年弱視大鼠離體腦組織切片視皮層V1M區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)的影響，為臨床治療成人弱視提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組標(biāo)準(zhǔn)清潔級(jí)2周齡Spargue Dawley大鼠16只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，無(wú)眼部疾患，雌雄不限，體質(zhì)量(22±5)g。將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和單眼形覺(jué)剝奪組，每組8只。正常對(duì)照組大鼠不做任何處理，單眼形覺(jué)剝奪組大鼠行右側(cè)眼瞼縫合術(shù)制備單眼形覺(jué)剝奪性弱視模型。

1.2主要試劑與儀器5-羥色胺鹽酸鹽(美國(guó)Sigma公司)，5-HT2CR拮抗劑SB 242084(美國(guó)APExBIO公司)；Hum bug電噪音消除器、Micro1401數(shù)模轉(zhuǎn)換器(英國(guó)Digitimer有限公司)，MODEL-97拉直儀(美國(guó)Sutter Instrument公司)，LEICA VT 1000S振動(dòng)切片機(jī)(美國(guó)Leica公司)，MINIPULS-3蠕動(dòng)泵(美國(guó)GILSON公司)，Master-9脈沖刺激器(以色列AMPI公司)，PZMTIII-BS精密立體變倍顯微鏡(美國(guó)WPI公司)，界面式孵育槽、記錄槽(自制)。

1.3單眼形覺(jué)剝奪性弱視模型的制作單眼形覺(jué)剝奪組大鼠乙醚吸入麻醉，自右眼內(nèi)眥至外眥剪除上、下瞼緣約1.5 mm，用6-0眼科縫線間斷水平褥式縫合上下瞼緣，創(chuàng)緣對(duì)齊并涂紅霉素眼膏，術(shù)后1周每天涂紅霉素眼膏，檢查創(chuàng)口及母鼠哺乳情況。正常對(duì)照組和單眼形覺(jué)剝奪組大鼠均于自然光線環(huán)境飼養(yǎng)至≥8周齡，再經(jīng)圖形視覺(jué)誘發(fā)電位(pattern visual evoked potential，P-VEP)檢測(cè)，單眼形覺(jué)剝奪組P100波波形穩(wěn)定性差、潛伏期延長(zhǎng)、振幅降低，提示模型制備成功。

1.4人工腦脊液和切片腦脊液的配制參照文獻(xiàn)[6]的方法配制人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)和切片腦脊液。ACSF的成分為：NaCl 126.0 mmol·L-1，KCl 3.0 mmol·L-1，MgSO42.0 mmol·L-1，NaH2PO41.25 mmol·L-1，NaHCO324.0 mmol·L-1，CaCl22.0 mmol·L-1，葡萄糖10.0 mmol·L-1；切片腦脊液成分為：蔗糖225.0 mmol·L-1，KCl 3.0 mmol·L-1，MgSO46.0 mmol·L-1，NaH2PO41.25 mmol·L-1，NaHCO324.0 mmol·L-1，CaCl20.5 mmol·L-1，葡萄糖10.0 mmol·L-1。

1.5大鼠視皮層切片的制備與孵育造模后6周，大鼠用100 g·L-1水合氯醛(3～4 mL·kg-1)進(jìn)行腹腔注射麻醉，用已通混合氧氣(95%O2+5%CO2)且預(yù)冷(0 ℃)的切片腦脊液快速心臟灌注，斷頭取腦，冠狀切取400 μm厚視皮層腦組織切片，視皮層的形態(tài)辨別參考文獻(xiàn)[7]，腦組織切片置于提前通混合氧氣≥30 min的ACSF中，孵育1 h待用。

1.6大鼠視皮層切片分組及視皮層V1M區(qū)LTP的誘導(dǎo)根據(jù)ACSF中加入藥物不同，將正常對(duì)照組大鼠視皮層切片作為A組(n=8)，將剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層切片分為B組(n=11)、C組(n=11)、D組(n=5)和E組(n=10)，將剝奪眼同側(cè)視皮層切片分為F組(n=4)、G組(n=4)、H組(n=8)和I組(n=4)。A、B、F組人工腦脊液不加任何藥物，C、G組加生理鹽水，D、H組加10 μmol·L-15-羥色胺鹽酸鹽，E、I組加10 μmol·L-1SB 242084和10 μmol·L-15-羥色胺鹽酸鹽。記錄槽內(nèi)放置1張視皮層切片，通有混合氧氣的ACSF(28～32 ℃)持續(xù)灌流入記錄槽，速度為3～4 mL·min-1。電極放置的位置參照文獻(xiàn)[8-9]：視皮層V1M區(qū)第Ⅱ/Ⅲ層放置充有ACSF的玻璃記錄電極，電阻為2～3 MΩ；視皮層第Ⅳ層放置由2根直徑為75 μm鎳鉻合金絲自制而成的刺激電極，Master-9脈沖刺激器輸出刺激(波寬：50 μs；頻率：0.1 Hz)，記錄基礎(chǔ)刺激之前先檢測(cè)刺激強(qiáng)度與神經(jīng)元場(chǎng)突觸后電位(field postsynaptic potential，fPSP)的關(guān)系，最適刺激強(qiáng)度約為最大反應(yīng)的40%～60%所對(duì)應(yīng)的刺激強(qiáng)度，待fPSP穩(wěn)定達(dá)10 min后，給予最適刺激強(qiáng)度的強(qiáng)直高頻刺激(high frequency stimulation，HFS)(100 Hz)誘導(dǎo)LTP，刺激參數(shù)維持恒定，持續(xù)記錄1 h。選取fPSP下行波振幅的10%和50%計(jì)算fPSP斜率，設(shè)定基礎(chǔ)刺激(10 min)fPSP斜率為100%，對(duì)HFS后 (51～60 min) fPSP斜率的變化進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

各組大鼠視皮層fPSP斜率比較結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、圖3。A、B、C、D、E、F、G、H、I組大鼠視皮層fPSP斜率分別為(198.1±13.5)%、(106.3±8.3)%、(106.3±8.3)%、(157.1±9.7)%、(102.6±4.7)%、(144.5±2.9)%、(144.5±2.9)%、(192.2±8.6)%和(129.7±13.5)%。A、B、F組大鼠視皮層fPSP斜率兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);A組大鼠視皮層fPSP斜率高于B、F組，B組大鼠視皮層fPSP斜率低于F組(P<0.001)。D組大鼠視皮層fPSP斜率高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-10.833，P<0.001)；H組大鼠視皮層fPSP斜率高于D、G組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-6.841、-10.616，P<0.001)；E組大鼠視皮層fPSP斜率低于D、I組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.872、-3.910，P<0.001，P<0.05)；I組大鼠視皮層fPSP斜率低于H組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.911，P<0.001)。

圖1A、B、F組大鼠視皮層fPSP斜率

Fig.1fPSPslopeofthevisualcortexofratsingroupA，B，F(xiàn)

A：剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層；B：剝奪眼同側(cè)視皮層；：C組；：D組；：G組；：H組；：代表HFS。

圖25-羥色胺鹽酸鹽對(duì)HFS誘導(dǎo)的單眼形覺(jué)剝奪大鼠雙側(cè)視皮層fPSP斜率的影響

Fig.2Effectof5-hydroxytryptaminehydrochlorideonthefPSPslopeofthebilateralvisualcortexinmonoculardeprivationratsinducedbyHFS

圖3SB242084聯(lián)合5-羥色胺鹽酸鹽對(duì)HFS誘導(dǎo)的單眼形覺(jué)剝奪大鼠雙側(cè)視皮層fPSP斜率的影響

Fig.3EffectofSB242084combined5-hydroxytryptaminehydrochlorideonthefPSPslopeofthebilateralvisualcortexinmonoculardeprivationratsinducedbyHFS

3 討論

哺乳動(dòng)物在胚胎時(shí)期視覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)開(kāi)始發(fā)育并持續(xù)至出生后，出生睜眼后，光線通過(guò)正常屈光間質(zhì)刺激視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)并傳導(dǎo)至視皮層，進(jìn)一步促進(jìn)視覺(jué)系統(tǒng)的發(fā)育[10]。大鼠視覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵期為出生后第14～45天，而成年期一般為出生后第8～48周齡[11]。研究表明，隨著視覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵期的結(jié)束，成年鼠仍具有突觸可塑性，而非既往認(rèn)為的隨著關(guān)鍵期的結(jié)束可塑性也終止[12-13]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)選擇出生后2周齡未睜眼大鼠行右側(cè)眼瞼縫合術(shù)，飼養(yǎng)至≥8周齡，建立單眼形覺(jué)剝奪性成年弱視大鼠模型。

既往研究表明，在視皮層第Ⅱ/Ⅲ層成功誘導(dǎo)LTP需要N-甲基-D-天冬氨酸受體(n-methyl-d-aspartic acid receptor，NMDAR)和α-氨基羥甲基惡唑丙酸受體(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor，AMPAR)的參與[13]。當(dāng)視皮層第Ⅳ層神經(jīng)元受到電流刺激后，突觸前神經(jīng)元釋放谷氨酸遞質(zhì)并與突觸后膜上的NMDAR和AMPAR結(jié)合，AMPAR被激活使NMDAR通道中的Mg2+移出，大量Na+和Ca2+進(jìn)入細(xì)胞，AMPAR通道磷酸化，電導(dǎo)增加，最終在視皮層第Ⅱ/Ⅲ層成功誘導(dǎo)出LTP[14]。以往有關(guān)視皮層LTP的誘導(dǎo)多采用TBS刺激模式，鑒于成年大鼠突觸可塑性下降，LTP不易被誘導(dǎo)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用脈寬較小且頻率較高的HFS來(lái)誘導(dǎo)成年大鼠視皮層LTP，以fPSP斜率作為觀測(cè)指標(biāo)。

5-HT是一種重要的胺類神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜和視皮層[15]，其與相應(yīng)受體結(jié)合可誘導(dǎo)長(zhǎng)期突觸可塑性和眼優(yōu)勢(shì)可塑性，它與腦內(nèi)的多巴胺、腎上腺素、乙酰膽堿等遞質(zhì)間也存在復(fù)雜的相互拮抗和相互協(xié)同的關(guān)系[16]。嚙齒類動(dòng)物初級(jí)視皮層密集分布著5-HT軸突纖維，這些纖維來(lái)源于中縫核，并將其投射到整個(gè)前腦，尤其視皮層V1M區(qū)[17]。藺靜靜等[18]研究認(rèn)為，豐富環(huán)境主要通過(guò)刺激感覺(jué)運(yùn)動(dòng)的方式再次激活成年弱視大鼠視皮層突觸可塑性。BARONCELLI等[19]通過(guò)高效液相色譜分析法發(fā)現(xiàn)，處于豐富環(huán)境的弱視大鼠視皮層5-HT含量較正常環(huán)境大鼠含量明顯升高。也有研究發(fā)現(xiàn)，出生后90 d內(nèi)一直處于豐富環(huán)境狀態(tài)下的成年雄性大鼠視皮層中含有大量5-HT，而雌性大鼠視網(wǎng)膜較多；出生后第90～150天內(nèi)處于豐富環(huán)境的成年大鼠視網(wǎng)膜和視皮層中均有大量5-HT，且無(wú)性別差異[15]。綜上所述，5-HT與成年大鼠視皮層突觸可塑性有相關(guān)性，這也和本研究結(jié)果5-羥色胺鹽酸鹽可提高成年弱視大鼠視皮層fPSP斜率相一致。PALACIOS等[20]應(yīng)用光鏡放射定量自顯影、基因克隆和原味雜交等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，5-HT受體類型復(fù)雜，多達(dá)14個(gè)亞型，其中5-HT2CR可通過(guò)激活突觸可塑性關(guān)鍵酶——磷酸肌醇特異性磷脂酶C(phosphatidylinositol-phospholipases C，PI-PLC)調(diào)整中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)，而且5-HT2CR在視皮層17區(qū)分布也很廣泛，該受體與NMDAR、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子也存在聯(lián)系。因此，本實(shí)驗(yàn)選用SB 242084和 5-羥色胺鹽酸鹽進(jìn)行干預(yù)，觀察它們對(duì)弱視大鼠視皮層V1M區(qū)LTP的影響，從而印證5-HT2CR參與視覺(jué)可塑性的變化。

視皮層V1M區(qū)稱為初級(jí)視皮層區(qū)，負(fù)責(zé)加工、處理視覺(jué)信息，也是最早參與視覺(jué)組織活動(dòng)的結(jié)構(gòu)[7]。目前公認(rèn)的視皮層上層神經(jīng)回路主要有2種：一種是從視皮層第Ⅳ層到第Ⅱ/Ⅲ層的垂直連接方式，另一種是從第Ⅱ/Ⅲ層到第Ⅱ/Ⅲ層的長(zhǎng)距離水平連接方式，2種連接方式均是功能相似神經(jīng)元相互聯(lián)系的固有形式，而這2種途徑在成熟模式方面存在差異，但均能通過(guò)中間神經(jīng)元成功誘發(fā)突觸反應(yīng)。LI等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在相同刺激模式下，垂直方向誘導(dǎo)LTP的振幅明顯高于水平方向，但水平方向刺激錐體神經(jīng)元誘導(dǎo)LTP振幅達(dá)最大所用時(shí)間最短，因此，他們認(rèn)為水平方向連接的神經(jīng)纖維較垂直方向成熟更早更快。因而本實(shí)驗(yàn)將視皮層V1M區(qū)第Ⅳ層放置刺激電極，第Ⅱ/Ⅲ層放置記錄電極，采用垂直方向誘導(dǎo)LTP，以進(jìn)一步研究視皮層突觸可塑性的機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，單眼形覺(jué)剝奪成年弱視大鼠剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層fPSP斜率較同側(cè)視皮層fPSP斜率小，這可能是由于約90%的大鼠視覺(jué)神經(jīng)纖維在視交叉交叉于對(duì)側(cè)，但相對(duì)于正常大鼠視皮層 fPSP斜率則明顯降低，說(shuō)明關(guān)鍵期行單眼形覺(jué)剝奪至成年期對(duì)大鼠雙側(cè)視皮層神經(jīng)傳遞均起抑制作用，進(jìn)一步推斷成年弱視大鼠視皮層經(jīng)驗(yàn)依賴眼優(yōu)勢(shì)可塑性受到影響。為恢復(fù)成年弱視大鼠視皮層突觸可塑性，本研究觀察了5-羥色胺鹽酸鹽對(duì)視皮層LTP的影響，結(jié)果顯示，在成年弱視大鼠剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層V1M區(qū)可成功誘導(dǎo)LTP，fPSP斜率較用藥前明顯增高；剝奪眼同側(cè)視皮層fPSP斜率較用藥前有一定增高，但均未達(dá)到正常水平，證明5-羥色胺鹽酸鹽在一定程度上可恢復(fù)成年弱視大鼠視皮層眼優(yōu)勢(shì)可塑性，這也與MAYA等[3]的觀點(diǎn)相一致。進(jìn)一步應(yīng)用5-HT2CR拮抗劑SB 242084，發(fā)現(xiàn)其可抵消5-羥色胺鹽酸鹽對(duì)剝奪眼對(duì)側(cè)視皮層fPSP斜率的助長(zhǎng)作用，而剝奪眼同側(cè)視皮層fPSP斜率也有一定程度下降，證明5-羥色胺鹽酸鹽主要通過(guò)5-HT2CR來(lái)恢復(fù)成年弱視大鼠視皮層眼優(yōu)勢(shì)可塑性，且PARK等[11]的研究結(jié)果與之相似。本研究中，部分視皮層切片HFS后fPSP斜率較基線明顯升高，隨即出現(xiàn)降低的現(xiàn)象，可能原因?yàn)榇笫竽X組織切片活性下降，且本實(shí)驗(yàn)樣本量較小，需進(jìn)一步增加樣本量研究。

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