孕期PM2.5暴露影響子代大腦發(fā)育中HMGB1/NF—κB通路的作用及機(jī)制研究

李文燕 郭亞楠 鄭昕蕊 張紅霞 于麗 江洪

[摘要] 目的 探討孕期PM2.5暴露影響子代大腦發(fā)育中HMGB1/NF-κB p65通路的作用。 方法 40只昆明小鼠孕鼠隨機(jī)分5組，每組8只。氣管滴注法向?qū)φ战M注30 μL PBS，PM2.5低、中、高劑量組各注0.25920、1.56695、3.45600 μg/μL PM2.5混懸液30 μL，孕期每3天注1次，共7次?？瞻捉M無(wú)處理。ELISA法檢測(cè)子代大腦皮層腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、γ-干擾素（IFN-γ）、高遷移率族蛋白1（HMGB1）、核因子κB p65（NF-κB p65）濃度；Western blot、RT-PCR法檢測(cè)HMGB1、NF-κB p65蛋白及mRNA變化。 結(jié)果 ELISA示與對(duì)照組相比，高、中劑量組IFN-γ、NF-κB p65升高而HMGB1下降（P < 0.05），高劑量組TNF-α升高（P < 0.05）。Western blot示高、中劑量組與對(duì)照組相比，HMGB1下降且NF-κB p65上升（P < 0.05）。PCR示HMGB1 mRNA無(wú)變化，高劑量組NF-κB p65 mRNA高于對(duì)照組（P < 0.05）。 結(jié)論 孕期PM2.5暴露使子代鼠大腦皮層產(chǎn)生炎癥，HMGB1/NF-κB通路可能起重要作用。

[關(guān)鍵詞] 大腦皮層；PM2.5；γ-干擾素；腫瘤壞死因子-α；高遷移率族蛋白1；核因子κB p65；子代鼠

[中圖分類(lèi)號(hào)] R715.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）04（a）-0022-04

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of HMGB1/NF-κB signal pathway affecting cerebral development of offspring after exposure to PM2.5 during pregnancy. Methods Fourty pregnant Kunming mice were randomly divided into 5 groups， 8 rats in each group. PM2.5 low-dose group， medium-dose group and high-dose group were instilled 30 μL PM2.5 suspension of 0.25920， 1.56695， 3.45600 μg/μL respectively by improved technique for rapid intratracheal instillation. The control group was instilled PBS of the same volume. The blank group received no treatments. Mice were instilled tracheally once every 3 days for 7 times during pregnancy. ELISA was used to measure the levels of TNF-α， IFN-γ， HMGB1 and NF-κB p65 in the cerebral cortex of offspring mice. Western blot and RT-PCR were used to detect the protein and mRNA expression of HMGB1 and NF-κB p65. Results ELISA showed that compared with the control group， the levels of IFN-γ， NF-κB p65 and HMGB1 in the high and middle dose groups were significantly lower （P < 0.05）； high-dose group TNF-α increased （P < 0.05）. Western blot showed that HMGB1 decreased and NF-κB p65 increased in the high and middle dose groups compared with the control group （P < 0.05）. PCR showed HMGB1 mRNA unchanged； high-dose group NF-κB p65 mRNA was higher than the control group （P < 0.05）. Conclusion PM2.5 exposure during pregnancy may cause inflammation in the cerebral cortex of offspring mice， and HMGB1/NF-κB pathway may play an important role.

[Key words] Cerebral cortex； PM2.5； IFN-γ； TNF-α； HMGB1； NF-κB p65； Offspring mice

大氣細(xì)顆粒物（AD≤2.5 μm，PM2.5）成分復(fù)雜，可吸附細(xì)菌、病毒、重金屬等。PM2.5通過(guò)呼吸進(jìn)入機(jī)體經(jīng)血液循環(huán)及胎盤(pán)影響孕婦和新生兒[1]。炎性反應(yīng)是孕期PM2.5暴露影響子代認(rèn)知的首要機(jī)制[2]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)孕期PM2.5暴露使子代鼠心、脾、肝等臟器結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)炎癥等病理改變[3]。目前關(guān)于PM2.5對(duì)子代腦發(fā)育影響機(jī)制的研究尚少。本研究通過(guò)檢測(cè)孕期PM2.5暴露后子代鼠大腦皮層TNF-α、IFN-γ、HMGB1、NF-κB p65變化，評(píng)估孕期空氣污染對(duì)胎兒神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型制備

雌性昆明小鼠40只，6～8周齡，體重（34±2）g，購(gòu)自青島動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20140001。按動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)處理動(dòng)物。室溫25℃，自由飲水、進(jìn)食。雌雄比2∶1合籠，次日查有陰栓者記為孕第1天。孕鼠隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組及PM2.5低、中、高劑量組，每組8只?？瞻捉M無(wú)處理；對(duì)照組注30 μL PBS；PM2.5低、中、高劑量組各注30 μL濃度為0.25920、1.56695、3.45600 μg/μL的PM2.5混懸液，采用氣管滴注法孕期每3天（即孕第1、4、7、10、13、16、19天）滴注，共7次。

1.2 PM2.5的采集和處理

用采樣器收集供暖季濰坊市大氣細(xì)顆粒物。細(xì)顆粒物濾膜裁成小塊浸入去離子水，低溫超聲振蕩，收集濾液。顆粒物懸液冷凍真空干燥，-20℃保存[4]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)用PBS稀釋細(xì)粒子。

1.3 主要試劑與儀器

HMGB1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcom公司，NF-κB p65單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，Multiskan FC型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 ELISA檢測(cè)子代鼠大腦皮層TNF-α、IFN-γ、HMGB1、NF-κB p65濃度變化 解剖各組2周齡子代鼠，剝離大腦皮層組織，冰上勻漿，4℃ 10 000 r/min離心15 min，測(cè)定蛋白濃度。按ELISA試劑盒操作。酶標(biāo)儀測(cè)450 nm吸光度值。

1.4.2 Western blot檢測(cè)子代鼠大腦皮層HMGB1、NF-κB p65蛋白表達(dá) 子代鼠（2周齡）大腦皮層組織置于冰上裂解提蛋白。取30 μg蛋白樣品行SDS-PADE電泳，恒壓90 V將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。將膜置于5%脫脂奶粉中，室溫封閉抗原2 h后分別放入一抗兔抗HMGB1（1∶8000）、兔抗NF-κB p65（1∶1000）中4℃低溫?fù)u床孵育過(guò)夜，二抗IgG室溫?fù)u床孵育2 h。GAPDH（1∶8000）作為對(duì)照，ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)。

1.4.3 RT-PCR檢測(cè)HMGB1、NF-κB p65 mRNA表達(dá) 測(cè)定子代鼠（2周齡）大腦皮層組織總RNA濃度和純度，各樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA行PCR擴(kuò)增。HMGB1上游引物：5′-GGCGAGCATCCTGGCTTATC-3′，下游引物： 5′-GGCTGCTTGTCATCTGCTG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度88 bp。NF-κB p65上游引物：5′-AGGCTTCTGGGCCTTATGTG-3′，下游引物：5′- TGCTTCTCTCGCCAGGAATAC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度111 bp。β-actin上游引物：5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，下游引物：5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度154 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min獲圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子代鼠大腦皮層中TNF-α、IFN-γ、HMGB1、NF-κB p65濃度變化情況

與對(duì)照組相比，PM2.5各劑量組子代鼠大腦皮層中TNF-α、IFN-γ、NF-κB p65濃度均升高，其中，高劑量組TNF-α濃度與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），高、中劑量組IFN-γ、NF-κB p65濃度與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；PM2.5各劑量組與對(duì)照組相比HMGB1濃度下降，其中，高、中劑量組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。對(duì)照組與空白組各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 子代鼠大腦皮層中HMGB1、NF-κB p65蛋白表達(dá)情況

Western blot示PM2.5各劑量組與對(duì)照組相比，子代鼠大腦皮層HMGB1蛋白表達(dá)降低，NF-κB p65蛋白表升高，其中高、中劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；對(duì)照組與空白組各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖2、3。

2.3子代鼠大腦皮層中HMGB1及NF-κB p65 mRNA表達(dá)情況

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳示PM2.5模型組與對(duì)照組相比，HMGB1 mRNA表達(dá)無(wú)明顯改變（P > 0.05）。高劑量組與對(duì)照組相比，子代鼠大腦皮層NF-κB p65 mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。而對(duì)照組與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖4、5。

3 討論

我國(guó)每年P(guān)M2.5污染可致約120萬(wàn)人過(guò)早死亡和2500萬(wàn)健康生命損失[5]。動(dòng)物腦組織暴露于PM2.5會(huì)損傷小腦、海馬等[6-8]。生命早期是中樞神經(jīng)形成的關(guān)鍵時(shí)期，孕期母體暴露于汽車(chē)尾氣顆粒物危害胎仔神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育[9]。污染空氣中雌鼠子代認(rèn)知受損，考慮是綜合因素作用于腦的先天免疫識(shí)別基因與神經(jīng)炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)所致[10]。孕期PM2.5暴露對(duì)胎兒神經(jīng)系統(tǒng)的毒性機(jī)制有待深入研究。

HMGB1是非組蛋白，在腦、肝、肺等器官極豐富。一般情況下主要在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，參與細(xì)胞分化、DNA修復(fù)等。機(jī)體受損時(shí)，細(xì)胞內(nèi)HMGB1經(jīng)活化細(xì)胞主動(dòng)分泌或壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放進(jìn)入胞外或外周循環(huán)發(fā)揮致炎作用[11-14]。細(xì)胞外HMGB1能與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體和Toll樣受體4結(jié)合[15-16]，激活NF-κB通路[16-17]，產(chǎn)生大量TNF-α等炎癥因子，引發(fā)炎癥[18-19]。本研究顯示與對(duì)照組相比，孕期PM2.5暴露導(dǎo)致模型組子代鼠大腦皮層中HMGB1蛋白表達(dá)下降，HMGB1 mRNA無(wú)改變，推測(cè)壞死或活化細(xì)胞經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑釋放HMGB1到細(xì)胞外或外周循環(huán)，星形膠質(zhì)細(xì)胞等分泌的HMGB1主要來(lái)自細(xì)胞核儲(chǔ)備而非新合成[20]，故檢測(cè)到模型組子代鼠大腦皮層HMGB1蛋白降低。PM2.5模型組NF-κB p65蛋白與對(duì)照組相比升高，高劑量組與對(duì)照組相比NF-κB p65 mRNA上升。孕期PM2.5暴露引起模型組大腦皮層TNF-α、IFN-γ濃度增高。

綜上所述，孕期一定劑量PM2.5暴露使子代鼠大腦皮層炎癥因子表達(dá)改變，HMGB1/NF-κB通路可能起關(guān)鍵作用。孕期PM2.5暴露影響子代腦發(fā)育是多機(jī)制調(diào)節(jié)的復(fù)雜過(guò)程，了解其對(duì)子代腦發(fā)育的影響對(duì)提高空氣污染預(yù)防意識(shí)及盡早建立孕婦和胎兒特異監(jiān)測(cè)指標(biāo)有重要意義。

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