山姜素抑制卵巢癌OVCAR—8細(xì)胞增殖遷移及其機(jī)制研究

曾靜 王璟 殷金鳳 宋琦

[摘要] 目的 探討山姜素對人卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞的增殖、遷移的抑制作用及其可能機(jī)制。 方法 以DMSO為溶劑對照，使用不同濃度山姜素（25、50、100、200和400 μmol/L）處理OVCAR-8不同時(shí)間（24、48和72 h）后，采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖活力；采用3D腫瘤微球形成實(shí)驗(yàn)檢測50 μmol/L山姜素處理7 d后腫瘤微球形成能力；使用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測100 μmol/L山姜素處理24 h后對遷移能力；采用Western blot法檢測不同濃度山姜素（50、100和200 μmol/L，以DMSO為對照）作用48 h后OVCAR-8細(xì)胞STAT3信號通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果 25～400 μmol/L山姜素對OVCAR-8細(xì)胞增殖均有抑制作用，且呈劑量-時(shí)間依賴效應(yīng)關(guān)系（均P < 0.05）；50 μmol/L山姜素處理組腫瘤微球直徑較DMSO組明顯減?。≒ < 0.05），而100 μmol/L山姜素組劃痕寬度明顯寬于DMSO對照組（P < 0.05）；此外，50、100和200 μmol/L山姜素處理組Bax、cleaved-caspase-3和-9的表達(dá)明顯增加，Bcl-2、p-STAT3、c-myc、survivin蛋白表達(dá)明顯減少，均呈一定的劑量依賴效應(yīng)關(guān)系（均P < 0.05）。而STAT3蛋白水平無明顯變化（P > 0.05）。 結(jié)論 山姜素對卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞增殖和遷移具有抑制作用，且可能與STAT3信號通路抑制以及線粒體凋亡通路激活相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 山姜素；卵巢癌；增殖；遷移；微球；凋亡

[中圖分類號] R711.75 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（a）-0013-05

[Abstract] Objective To explore the effect of alpinetin on human ovarian cancer cell line OVCAR-8 and its mechanism. Methods OVCAR-8 cells were treated with different concentrations of alpinetin （25， 50， 100， 200 and 400 μmol/L， DMSO as control） for different hours （24， 48 and 72 h）， then cell viabilities were detected by CCK-8 assays. 3D spheroid assay was used to measure the spheroid formation capacity of OVCAR-8 cell after treated with 50 μmol/L alpinetin （DMSO as control） for 7 days. Besides， wound healing assay was used to measure the migration capacity of OVCAR-8 cell after treated with 100 μmol/L alpinetin （DMSO as control） for 24 h. In addition， Western blot was used to detect the protein levels of STAT3 signaling related and apoptosis related proteins in OVCAR-8 cells after alpinetin treatments （50， 100 and 200 μmol/L， DMSO as control） for 48 h. Results 25-400 μmol/L alpinetin had remarkable inhibiting effects on OVCAR-8 cells and in a dose-and time-dependent manner（all P < 0.05）. After 7 days′ treatment， the diameter of spheroid in 50 μmol/L alpinetin group was significantly shorter than DMSO control group （P < 0.05）. Besides， the width of wound in 100 μmol/L alpinetin group was significantly longer than DMSO control group after treatment for 24 h （P < 0.05）. In addition， the protein levels of Bcl-2， p-STAT3， c-myc and survivin were decreased in 50， 100 and 200 μmol/L group of OVCAR-8 cells than DMSO control group after 48 exposure. On the contrary， the protein level of Bax， cleaved-caspase-3 and -9 was increased （all P < 0.05）， and there were no significantly changes in STAT3 levels （P > 0.05）. Conclusion Alpinetin can inhibit the proliferation and migration of OVCAR-8 cells，its mechanism may be related to the inhibition of STAT3 signaling pathway and the activation of mitochondrial apoptosis signaling.

[Key words] Alpinetin； Ovarian cancer； Proliferation； Migration； Spheroid； Apoptosis

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，也是女性癌癥相關(guān)死亡的第五大常見原因[1]。其治療主要是以鉑類藥物為核心的化學(xué)治療，近年來化療藥物耐藥成為卵巢癌復(fù)發(fā)和死亡率上升的重要因素，因此發(fā)現(xiàn)新的抗卵巢癌藥物一直以來都是卵巢癌研究的熱點(diǎn)之一。山姜素是提取自草豆蔻根莖或種子的一種天然類黃酮類物質(zhì)。具有鎮(zhèn)痛、抗炎和抗氧化作用[2]。近年來，國外有研究者將山姜素運(yùn)用于抗肺癌及消化道等腫瘤的研究中[3-7]，并證實(shí)其抗腫瘤作用，但其對卵巢癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制尚不明確。因此，研究山姜素對人卵巢癌細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制，對抗卵巢癌新藥發(fā)現(xiàn)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

山姜素（Alpinetin）購于成都曼斯特生物科技有限公司（A1051，HPLC純度≥98%）；RPMI1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS，20012027）、胎牛血清購于美國賽默飛世爾科技有限公司；RAPI裂解液（P0013B）、CCK-8試劑盒（C0038）和BCA試劑盒（P0012）購于碧云天生物技術(shù)有限公司；抗GAPDH（2188R）、β-actin（0061R）、STAT3（1141R）、p-STAT3（1658R）、c-myc（4963R）、Survivin（0615R）、Bcl-2（0032R）和Bax（20386R）一抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；抗cleaved-caspase-3（9664）和cleaved-caspase-9（20750）購自美國CST公司；羊抗兔熒光二抗（C40109-04）購于美國LI-COR公司；CO2培養(yǎng)箱為德國BINDER公司產(chǎn)品（BD53型）；倒置顯微鏡為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品（CKX31型）；酶標(biāo)儀為美國PerkinElmer公司產(chǎn)品（1420型）；電泳電轉(zhuǎn)儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品（DYCZ-40D型）；雙色紅外激光成像系統(tǒng)為美國LI-COR公司產(chǎn)品（Odyssey）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞購于博奧派克生物有限公司（BI0-247），培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL），于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖活力檢測 OVCAR-8細(xì)胞以3×103細(xì)胞/孔接種于96孔板，24 h后更換含不同濃度山姜素的培養(yǎng)基100 μL。藥物濃度分別為25、50、100、200和400 μmol/L，以DMSO為溶劑對照組，分別于24、48、72 h更換CCK-8檢測試劑100 μL（90 μL RMPI1640培養(yǎng)基+10 μL CCK-8液），于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長檢測各孔的吸光度值（A）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖活力：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組平均A值/對照組平均A值）×100%。

1.2.3 3D腫瘤微球形成實(shí)驗(yàn) OVCAR-8細(xì)胞以3×103細(xì)胞/孔接種于每孔含5 μL膠原蛋白的超低黏附96孔板，24 h后采用倒置顯微鏡拍照，拍照后加入山姜素（50 μmol/L），以DMSO為對照；7 d后再次拍照記錄，計(jì)算腫瘤微球直徑。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn) OVCAR-8細(xì)胞以2×105細(xì)胞/孔接種于六孔板，待細(xì)胞長至完全融合后采用200 μL槍頭在中央劃痕，PBS沖洗后采用倒置顯微鏡拍照；換液后用100 μmol/L處理24 h，以DMSO為對照，再次使用倒置顯微鏡拍照，計(jì)算劃痕寬度。

1.2.5 Western blot 以DMSO為對照，采用不同濃度（50、100和200 μmol/L）山姜素處理OVCAR-8細(xì)胞48 h，隨后使用RIPA裂解液（含1%苯甲基磺酰氟）提取細(xì)胞蛋白，使用BCA法測定蛋白樣品濃度。以每孔30 μL蛋白體系，行10% SDS-PAGE凝膠電泳并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；3%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃搖床孵育過夜；洗膜后加入熒光山羊抗兔二抗室溫?fù)u床孵育1 h；洗膜后于雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描收集熒光信號。以GAPDH或β-actin為內(nèi)參照，采用QuantityOne-v4.6.2軟件對Western條帶進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnet t法，組內(nèi)兩兩比較采用Tukey法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山姜素對卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞增殖活力的作用

與DMSO對照組比較，采用25、50、100、200和400 μmol/L山姜素處理卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞24、48和72 h后，細(xì)胞活力明顯下降，增殖受到明顯抑制，且呈劑量-時(shí)間依賴效應(yīng)關(guān)系，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1。

2.2 山姜素對卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞腫瘤微球形成的影響

與DMSO對照組比較，50 μmol/L山姜素處理卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞7 d后，腫瘤微球直徑明顯減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2。

2.3 山姜素對卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞遷移的影響

100 μmol/L山姜素處理卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞24 h后，劃痕寬度明顯大于DMSO對照組，細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3。

2.4 山姜素對卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞STAT3信號通路的影響

與DMSO對照組比較，各處理組STAT3蛋白水平無明顯變化（P > 0.05），而50、100、200 μmol/L山姜素作用48 h后，p-STAT3、c-myc以及Survivin蛋白表達(dá)明顯減少（P < 0.05）。此外，與50 μmol/L組比較，100 μmol/L組細(xì)胞p-STAT3、c-myc以及Survivin蛋白表達(dá)明顯減少（P < 0.05），同時(shí)，與100 μmol/L組比較，200 μmol/L組細(xì)胞p-STAT3和c-myc蛋白表達(dá)下調(diào)（P < 0.05），Survivin蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。因此，山姜素能下調(diào)p-STAT3、c-myc以及Survivin蛋白表達(dá)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)關(guān)系。見圖4。

2.5 山姜素對山姜素對卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與DMSO對照組比較，50 μmol/L山姜素作用48 h后，Bcl-2蛋白水平明顯減少、Bax和cleaved-caspase-9蛋白水平明顯增加（P < 0.05），而cleaved-caspase-3蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。此外，與50 μmol/L組比較，100 μmol/L組細(xì)胞Bcl-2蛋白水平明顯減少，Bax和cleaved-caspase-3，cleaved-caspase-9蛋白水平明顯增加（P < 0.05）。同時(shí)，與100 μmol/L組比較，200 μmol/L組細(xì)胞cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白水平明顯增加（P < 0.05），Bcl-2和Bax蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。因此，山姜素能下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，增加促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9蛋白水平，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)關(guān)系。見圖5。

3 討論

卵巢癌因其發(fā)現(xiàn)是多為晚期，是女性死亡率最高的生殖道惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的健康[1]。山姜素是提取自草豆蔻根莖或種子的一種天然類黃酮類物質(zhì)，研究表明山姜素對于多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用[2-7]。本實(shí)驗(yàn)用山姜素體外實(shí)驗(yàn)研究觀察其對卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞的增殖和遷移抑制作用，結(jié)果提示山姜素具有抗卵巢癌治療潛能。

首先，CCK-8細(xì)胞活力檢測結(jié)果提示，山姜素在25～400 μmol/L濃度范圍內(nèi)對OVCAR-8細(xì)胞的增殖活力均有抑制作用，并呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)關(guān)系。此外本研究還通過3D腫瘤微球形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了山姜素對OVCAR-8細(xì)胞的增殖活力的抑制作用。除了快速增殖的特性，侵襲遷移也是卵巢癌的惡性習(xí)性之一，因此本研究還通過劃痕實(shí)驗(yàn)來檢測山姜素對卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移能力的作用，結(jié)果提示，山姜素可明顯抑制OVCAR-8細(xì)胞的遷移能力。

線粒體凋亡途徑是腫瘤細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一，Bcl-2家族成員在腫瘤細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮重要作用。Bax轉(zhuǎn)位入核促進(jìn)Caspase-9活化進(jìn)而剪切激活下游的caspase-3，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而Bcl-2可抑制Bax的作用[8-14]。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度山姜素處理組OVCAR-8細(xì)胞后促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3和-9表達(dá)明顯增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)。此外，在肺癌和消化道腫瘤的相關(guān)研究中也證實(shí)山姜素可促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)[3]，提示山姜素可通過增加Bax/Bcl-2比例，激活以線粒體為中心的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

STAT3信號通路腫瘤相關(guān)的重要信號通路。磷酸化活化的STAT3轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核，進(jìn)而促進(jìn)包括c-myc、cyclin-D1、Mcl-1、survivin等在內(nèi)的一系列基因的表達(dá)，從而參與卵巢癌發(fā)生、增殖、侵襲、耐藥和復(fù)發(fā)[15-20]。本研究為了研究STAT3信號通路在山姜素誘導(dǎo)卵巢癌OVCAR-8細(xì)胞增殖和遷移抑制中的作用，結(jié)果提示，山姜素可通過抑制STAT3信號通路進(jìn)而發(fā)揮抗卵巢癌作用。此外，肺癌與消化道腫瘤的相關(guān)研究表明，PI3K/Akt和Notch信號通路也參與山姜素的抗腫瘤作用[3，6]，因此，我們猜測山姜素可通過對多條信號通路的調(diào)控從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。

綜上所述，山姜素是一種具有潛在抗人卵巢癌作用的中藥活性成分，可通過抑制STAT3信號通路來抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移，并通過線粒體凋亡途徑促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，為抗卵巢癌新藥的研發(fā)開辟了新的領(lǐng)域。

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