人源程序性死亡配體PD-L2蛋白的原核表達與抗血清制備

楊娟娟， 劉 照， 夏菁潞， 羅 嶺， 俞博彤， 孟 春

(福州大學生物科學與工程學院， 福建 福州 350116)

0 引言

目前， 全球癌癥死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)的近六分之一， 加強癌癥的篩查和早期診斷是一項具有挑戰(zhàn)性的任務. PD-1/PD-Ls信號通路是目前廣為研究的抗癌靶點之一[1-3]， 可充分利用人體自身的免疫系統(tǒng)抵御、 抗擊癌癥. 初始T細胞活化離不開抗原肽-MHC復合物與T細胞表面受體(T cell receptor， TCR)的相互作用， 但同時需要抗原遞呈細胞表面(antigen-presenting cell， APC)的共刺激分子結(jié)合其表面的相應受體提供第二刺激信號. B7家族作為唯一能從APC單向傳送信號至T細胞的共刺激分子， 可以調(diào)控免疫信號的強度、 持續(xù)時間和過程[4]. 程序性死亡受體1(PD-1)與其配體PD-L1/PD-L2是B7家族的重要成員， 可激活細胞內(nèi)的抑制信號， 誘導T細胞凋亡， 抑制自身免疫應答反應， 從而導致腫瘤細胞的免疫逃逸和自身免疫相關疾病的發(fā)生[5].

2001年， Tseng等[6]通過篩選鼠源樹突狀細胞和巨噬細胞的基因庫發(fā)現(xiàn)了PD-L2， 并表明該蛋白參與樹突狀細胞發(fā)揮功能的過程. Latchman等[7]報道： PD-L2蛋白是PD-1蛋白的第二個配體分子， 可以顯著地抑制T細胞受體介導的CD4+T細胞的增殖和細胞因子的產(chǎn)生； 且PD-L2蛋白在經(jīng)干擾素γ處理的抗原遞呈細胞和正常組織細胞以及腫瘤細胞上的表達量顯著上調(diào). 特異性抗體分析實驗表明， PD-L2蛋白僅僅表達在樹突狀細胞和巨噬細胞上； 基于PD-L2蛋白的表達模式， PD-L2蛋白選擇性地作用于淋巴器官[6, 8]. 更為引人矚目的是， 通過Th2細胞可以上調(diào)巨噬細胞上PD-L2蛋白的表達[9]. Okazaki等[10]報道PD-1蛋白的胞質(zhì)尾區(qū)的免疫受體基序ITSM與PD-L2蛋白相互作用， 通過招募SHP-1或SHP-2等磷酸酶產(chǎn)生抑制信號， 從而導致下游的TCR或BCR信號效應器去磷酸化， 最終產(chǎn)生負性免疫調(diào)控信號. 位于抗原遞呈細胞上的PD-L2蛋白還可以抑制T細胞的自體反應， 從而產(chǎn)生免疫耐受； 位于薄壁細胞上的PD-L2蛋白可以通過抑制效應T細胞維持免疫承受能力， 從而保護組織不被破壞[11]. PD-L2的表達量變化是HIV疾病進展的重要生物標志， 阻斷PD-1/PD-L2途徑可以提高T細胞增殖能力[12-13]； 在寄生蟲感染中， 單獨阻斷PD-L2能減輕巨噬細胞對T細胞的抑制能力[14]； PD-L2的表達量變化與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展進程密切相關[3].

人們不斷探究PD-L2蛋白的功能， PD-1/PD-L2信號通路被認為是負性免疫調(diào)控分子的關卡[15]， 并且發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞上高表達PD-L2蛋白， 通過PD-L2與T細胞表面受體PD-1分子的結(jié)合， 傳遞負性抑制信號， 躲避CD8+T細胞的殺傷作用， 減弱機體抗腫瘤免疫應答， 造成腫瘤細胞的免疫逃逸. 因此， 人源PD-L2(hPD-L2)作為腫瘤發(fā)生、 發(fā)展、 轉(zhuǎn)移以及腫瘤預后的重要指標， 可以利用免疫組化技術(IHC)指導腫瘤的診斷和治療[16]. hPD-L2基因， 定位于9號染色體長臂(9q24.2)， cDNA全長約為1.7kb， 且該蛋白是由273個氨基酸殘基組成的跨膜蛋白， 包含有位于N端的胞外免疫球蛋白樣IgV結(jié)構(gòu)域、 IgC結(jié)構(gòu)域、 跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)[17]. 本研究分別選取hPD-L2蛋白的主要抗原表位區(qū)IgV Domain(包含20～123位的氨基酸殘基， hPD-L220～123)和整個胞外區(qū)(包含IgV Domain和IgC Domain， 氨基酸殘基包含20～208， hPD-L220～208)， 經(jīng)原核表達和純化， 制備高滴度、 高特異性的鼠抗人多抗血清.

1 材料和方法

1.1 材料

蛋白表達載體pET-27b， 宿主菌DH-5α和RossetaTM(DE3)感受態(tài)細胞均由本實驗室保存； hPD-L2的基因(Gene ID： NM_025239.3)由南京金斯瑞公司合成； 分子克隆所使用的上下游引物由生工生物工程(上海)有限公司合成.

1.2 試劑與儀器

分子克隆所使用的TapDNA聚合酶、 2×dNTP、 10×PCR buffer、 限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI與T4 DNA 連接酶以及蛋白Marker均購自中國Takara公司； 質(zhì)粒提取與純化試劑盒、 膠回收試劑盒、 卡那霉素、 尿素、 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以及其他化學試劑均購自生工生物工程(上海)有限公司； 用于LB培養(yǎng)基的胰蛋白胨和酵母提取物購自英國Oxoid公司； 弗式完全佐劑和弗式不完全佐劑購自美國Sigma公司； 免疫組化實驗相關試劑、 ELISA相關試劑均由福州邁新生物技術開發(fā)有限公司提供. 所使用的儀器有： 高速冷凍離心機(Eppendorf AG， 德國Eppendorf公司)； pH計(Orion3 STAR， 美國Thermo Fisher公司)； 超凈臺(SW-CJCO， 蘇州凈化設備有限公司)； 超聲波細胞破碎儀(JY92-2D， 寧波新芝生物科技股份有限公司)； 紫外-可見分光光度計(752型， 上海第三分析儀器廠)； 生物安全柜(上海力康科學儀器公司)； 倒置顯微鏡(XDS-1B， 德國萊卡公司)； PCR擴增儀(Eppendorf， 德國Eppendorf公司)和超低溫冰箱(美國Thermo Fisher公司).

1.3 方法

1) pET-27b-hPD-L220～123和pET-27b-hPD-L220～208重組質(zhì)粒的構(gòu)建. 利用Primer Premier 5.0軟件分別設計hPD-L2蛋白的胞外免疫球蛋白樣IgV結(jié)構(gòu)域(hPD-L220～123)和整個胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域(包括免疫球蛋白樣IgV結(jié)構(gòu)域和IgC結(jié)構(gòu)域， hPD-L220～208)的引物(見表1). 以hPD-L2的DNA為模板， 利用表1中的引物， 進行聚合酶鏈式反應(PCR)大量擴增hPD-L220～123的基因片段， 擴增體系為50 μL， PCR的反應條件為： 94 ℃、 5 min， 94 ℃、 30 s， 60.3 ℃、 30 s， 72 ℃、 45 s， 35個循環(huán)， 72 ℃、 10 min. 利用相同方法大量擴增hPD-L220～208的基因片段， 擴增體系為50 μL， PCR的反應條件為： 94 ℃、 5 min， 94 ℃、 30 s， 65 ℃、 30 s， 72 ℃、 45 s， 35個循環(huán)， 72 ℃、 10 min. 同時利用NdeI和XhoI雙酶切上述擴增的hPD-L220～123與hPD-L220～208的基因片段和pET-27b載體， 將二者連接， 轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞， 挑選單菌落進行PCR鑒定， 將陽性菌落送至測序公司進行測序， 分別將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pET-27b-hPD-L220～123和pET-27b-hPD-L220～208. 提取測序結(jié)果正確的單菌落重組質(zhì)粒， 轉(zhuǎn)化至RossetaTM(DE3)感受態(tài)細胞進行蛋白的表達與純化.

表1 構(gòu)建hPD-L2重組質(zhì)粒所使用的引物

注： 下劃線表示限制性內(nèi)切酶所對應的堿基序列

2) hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白的表達與純化. 分別挑取含有重組質(zhì)粒pET-27b-hPD-L220～123和pET-27b-hPD-L220～208的單克隆RossetaTM(DE3)菌落， 接種于10 mL含有50 μg·mL-1卡那抗生素的LB培養(yǎng)基中， 過夜振蕩培養(yǎng)(37 ℃， 220 r·min-1)， 按照1∶100的體積比接種于1 L含有50 μg·mL-1卡那抗生素的LB培養(yǎng)基中， 于37 ℃和220 r·min-1條件下繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h(OD600 nm約0.9)， 加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG， 于37 ℃和200 r·min-1條件下誘導5 h. 于4 000 r·min-1、 4 ℃、 離心30 min收集菌體， 利用PBS緩沖液洗滌菌體3次， 然后利用50 mL的PBS緩沖液重懸菌體， 超聲破碎， 收集上清， 用30 mL含有8 mol·L-1尿素的PBS緩沖液溶解沉淀， 并利用Ni-NTA柱進行親和層析純化. 將Ni-NTA柱親和層析純化后的蛋白進行透析復性， 置于復性液(100 mmol·L-1Tris-HCl ， pH 8.5， 100 mmol·L-1L-Arginine， 200 mmol·L-1NaCl， 0.2 mmol·L-1GSH， 0.2 mmol·L-1GSSG， 0.099 mmol·L-1NDSB， 4.6 g·L-1glycerol)， 于4 ℃條件下復性12 h， 復性后的蛋白于4 ℃、 11 000 r·min-1離心30 min， 收集上清， 濃縮至5 mg·mL-1.

3) 圓二色(CD)譜實驗. 在室溫下， 利用JASCO J-810圓二色譜儀測定蛋白的遠紫外圓二色特征. 分別準備蛋白質(zhì)量濃度為0.3 mg·mL-1的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白， 樣品池的光徑為0.1 cm， 設置采樣參數(shù)： 掃描速率100 nm·min-1， 狹縫寬度2 nm， 采樣間隔0.2 nm， 響應時間1 s， 掃描波長260 ～190 nm. 取連續(xù)3次掃描的平均值并扣除緩沖液背景的影響.

4) Western-blot法鑒定重組蛋白. 將純化后的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)轉(zhuǎn)移至PVDF膜， 加入5%(質(zhì)量分數(shù)) BSA-TBST于37 ℃封閉1 h. 洗膜3次， 每次3 min， 加入從CST購買的兔抗人PD-L2單抗作為一抗于37℃孵育1h. 洗膜后加入HRP標記的羊抗鼠二抗于37 ℃孵育1 h， 洗膜， 利用ECL法檢測實驗結(jié)果.

5) 多抗血清制備及滴度測定. 分別將純化后的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白利用生理鹽水稀釋至質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1， 然后與等體積的弗氏完全佐劑混合， 利用乳化器將混合物乳化均勻. 對Balb/c雌性小鼠進行免疫， 首次免疫劑量為100 μg·只-1， 加強免疫兩次(時間間隔為14 d， 兩個重組蛋白質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1, 樣品與弗氏不完全佐劑混勻)， 免疫劑量為50 μg·只-1. 免疫前3 d的血清作為空白對照； 第3次免疫10 d后, 斷尾取血清, 利用間接ELISA法測定多抗的滴度.

6) 多抗血清的效價測定. 分別以高純度的質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白作為包被抗原， 每孔包被100 μL、 4 ℃過夜， 同時將Balb/c雌性小鼠免疫前3 d的血清作為陰性對照， 利用間接ELISA法檢測經(jīng)hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白免疫的Balb/c雌性小鼠血清中的抗體效價.

7) 多抗血清的特異性檢測. 采用常規(guī)Western-blot法檢測制備的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白的多抗血清的效果， 具體步驟按節(jié)1.3的4)進行， 其中一抗為制備的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白的多抗血清(1∶1 000， 摩爾比)， 二抗為HRP標記的羊抗鼠抗體.

8) 多抗血清的免疫組化法(IHC)評估與鑒定. 利用hPD-L2蛋白陽性表達的胰腺組織切片進行免疫組化實驗， 以hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白的免疫血清作為待測一抗， 以CST兔抗人PD-L2單抗作為陽性對照， 以未免疫前對應的Balb/c雌性小鼠的血清作為陰性對照.

2 實驗結(jié)果

2.1 pET-27b-hPD-L220～123和pET-27b-hPD-L220～208重組質(zhì)粒的構(gòu)建

圖1 hPD-L220～123和hPD-L220～208對應基因片段的PCR產(chǎn)物的結(jié)果圖Fig.1 PCR products of hPD-L220-123and hPD-L220-208

以合成的hPD-L2基因為模板， 利用PCR方法成功擴增hPD-L220～123和hPD-L220～208相應的基因片段， 其大小分別為312 bp和567 bp(見圖1)， 然后將二者分別插入至pET-27b載體獲得相應的重組質(zhì)粒， 最后將經(jīng)PCR驗證和基因測序表明正確的重組質(zhì)粒pET-27b-hPD-L220～123和pET-27b-hPD-L220～208分別轉(zhuǎn)化至RossetaTM(DE3)感受態(tài)細胞進行蛋白的表達與純化.

2.2 hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白的表達、 純化與鑒定

按照節(jié)1.3方法2)對hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白進行誘導表達， 可使帶有His標簽的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白得到很好的表達， SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示. 相應融合蛋白的相對分子質(zhì)量分別約為14和27 ku(見圖2(a)泳道2和圖2(b)泳道2)， 與理論相對分子質(zhì)量相符. 將上述兩個重組蛋白的菌體進行超聲破碎， 分別取上清與沉淀進行SDS-PAGE鑒定， 發(fā)現(xiàn)在菌體裂解液上清中均未檢測到融合蛋白表達(見圖2(a)泳道3和圖2(b)泳道3)， 而只在重組菌體的沉淀中檢測到重組蛋白表達(見圖2(a)泳道4和圖2(b)泳道4)， 說明hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白是以包涵體的形式表達的. 將hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白的包涵體經(jīng)8 mol·L-1脲溶解變性， 0.45 μm的濾膜過濾， 利用Ni-NTA柱親和層析法純化， 經(jīng)復性液復性可獲得純度達到95%左右的融合蛋白(見圖2(a)泳道5和圖2(b)泳道5).

圖2 hPD-L220～123蛋白和hPD-L220～208蛋白表達與純化的SDS-PAGE結(jié)果圖Fig.2 SDS-PAGE gel analysis of expression and purification of hPD-L220-123and hPD-L220-208

為了驗證復性后的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白的折疊情況， 對純化后這兩個重組蛋白進行CD實驗. hPD-L220～123重組蛋白的遠紫外CD譜圖顯示： 在195 nm有一個明顯的正峰， 而在215 nm有一個明顯的負峰， 且二級結(jié)構(gòu)的含量分別為6.6%的α-helix、 60.4%的β-sheet以及33%的coil(見圖3(a)). hPD-L220～208重組蛋白的遠紫外CD譜圖顯示： 在195 nm有一個明顯的正峰， 而在216 nm有一個明顯的負峰， 且二級結(jié)構(gòu)的含量分別為17.1%的α-helix、 58.1%的β-sheet以及24.8%的coil(見圖3(b)). 上述CD實驗結(jié)果表明， 經(jīng)復性后的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白折疊較好， 二級結(jié)構(gòu)均以β-sheet折疊為主， 可進行后續(xù)制備多抗血清實驗.

圖3 hPD-L220～123蛋白和hPD-L220～208蛋白的CD譜圖Fig.3 Analysis of purified hPD-L220-123and hPD-L220-208 by far UV CD spectrometry

利用從CST購買的兔抗人PD-L2單抗對純化的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白進行Western-blot鑒定， 結(jié)果如圖4所示. 圖4表明： 分別位于14和27 ku處的純化hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白與兔抗人的PD-L2抗體有特異性反應(見圖4 泳道1和圖4 泳道3)， 與預期的結(jié)果一致； 而陰性對照， 即轉(zhuǎn)入pET-27b空載體的菌株， 在IPTG誘導后， 無任何特異性條帶出現(xiàn)(見圖4 泳道2和圖4 泳道4). Western-blot鑒定實驗結(jié)果表明， 本研究所表達與純化的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白具有較好的免疫原性， 可進行后續(xù)的制備多抗血清實驗.

圖4 hPD-L220～123and hPD-L220～208的Western-blot鑒定結(jié)果圖Fig.4 Western blotting analysis of hPD-L220-123and hPD-L220-208

2.3 hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白的多抗血清的制備、 滴度測定與效價測定

按照節(jié)1.3方法5)制備鼠抗人的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白的多抗血清， 采用斷尾取血的方式對3次免疫后的Balb/c雌性小鼠進行取血， 將取得的血于室溫靜置30～60 min， 8 000 r·min-1、 4 ℃離心10 min， 移取上清即為免疫后的血清. 將第一次免疫前3 d取的小鼠血清作為陰性對照， PBS作為空白對照. 分別包被5 μg·mL-1的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白， 利用間接ELISA法測定抗體滴度與效價， 列于表2. 由表2可知， 制備的鼠抗人的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白的多抗血清中抗體效價均高于106， 表明制備的多抗均獲得足夠的抗體滴度和親和力.

表2 hPD-L220～123and hPD-L220～208重組蛋白的免疫血清滴度

注： OVER為吸光值較大， 不在測量顯示范圍內(nèi)

2.4 hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白的多抗血清的特異性檢測

圖5 Western-blot法鑒定多抗血清Fig.5 Western blotting analysis of multiple antiserum

圖5為Western-blot法鑒定多抗血清的結(jié)果. 利用從Sino Biological 公司購買的hPD-L2蛋白為檢測抗原， 將從CST購買的兔抗人PD-L2抗體作為陽性對照(見圖5泳道1)， 以未免疫的Balb/c雌性小鼠血清作為陰性對照(見圖5泳道2)， 采用Western-Blot方法對制備的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白的多抗血清的特異性進行檢測. Western-Blot結(jié)果顯示： 所制備的多抗血清與購買的hPD-L2蛋白的單抗均在hPD-L2蛋白相應的位置出現(xiàn)了特異性反應條帶(見圖5泳道3和4)， 而陰性對照則在hPD-L2蛋白相應位置無特異性反應條帶. 該實驗結(jié)果表明： hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白作為免疫原所制備的多抗血清能夠特異性地識別hPD-L2蛋白.

2.5 hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白的多抗血清的IHC評估與鑒定

選用hPD-L2蛋白大量表達的胰腺組織切片進行實驗， 利用IHC法對制備的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白的多抗(稀釋1 500倍作為待測一抗)進行評估與鑒定， 以從CST購買的兔抗人PD-L2單抗作為陽性對照， 以未免疫的Balb/c雌性小鼠血清作為陰性對照. 免疫組化的陽性結(jié)果呈棕色顯示， 且PD-L2陽性結(jié)果應準確定位于細胞膜上， 分析結(jié)果見圖6. 作為陽性對照的兔抗人PD-L2單抗在hPD-L2蛋白陽性表達的胰腺組織切片的細胞膜定位較清晰、 準確， 且無非特異性著色(見圖6(a)). 作為陰性對照的未免疫Balb/c雌性小鼠血清在hPD-L2蛋白陽性表達的胰腺組織切片上無細胞膜定位(見圖6(b)). 與陰性對照相比， hPD-L220～123蛋白3次免疫后的多抗血清在hPD-L2蛋白陽性表達的胰腺組織切片上具有陽性染色， 但是與陽性對照相比， 染色較弱， 且膜定位不明顯(見圖6(c)). hPD-L220～208蛋白3次免疫后的多抗血清在hPD-L2蛋白陽性表達的胰腺組織切片上具有較為明顯的陽性染色結(jié)果， 且膜定位較為清晰與準確， 與陽性對照的結(jié)果較為一致(見圖6(d)).

圖6 多抗血清的免疫組化分析Fig.6 Immunohistochemistry assay of multiple antiserum

3 結(jié)語

hPD-L2在多種惡性腫瘤， 如肺癌、 肝癌、 食管癌、 胰腺癌、 子宮頸癌和卵巢癌細胞中呈異常表達[18-20]， 因此， 可采用IHC的方法對組織或細胞中的PD-L2蛋白進行定量檢測和精確定位， 以此指導腫瘤的診斷、 治療以及準確評價腫瘤預后療效. 本研究大量制備了hPD-L220～123和hPD-L220～208的重組蛋白， 經(jīng)Ni-NTA柱純化和復性后， 重組蛋白的純度均達到了95%以上. CD實驗結(jié)果表明， 制備的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白經(jīng)包涵體變復性后空間折疊較好， 且以β-sheet折疊的二級結(jié)構(gòu)為主. Western-blot實驗結(jié)果表明制備的hPD-L220～123和hPD-L220～208重組蛋白經(jīng)包涵體變復性后具有較好的免疫原性， 因此恢復了較好的生物學功能. 重組蛋白hPD-L220～123和hPD-L220～208作為免疫原免疫Balb/c雌性小鼠制備鼠抗人的多抗血清， 經(jīng)間接ELISA法檢測其效價均達到1∶106， 表明多抗血清均具有良好的滴度， 且在Western-blot應用中具有較強的特異性和敏感性. 但IHC實驗的評估與鑒定結(jié)果表明： hPD-L220～208重組蛋白作為免疫原制備的多抗血清具有明顯的陽性染色結(jié)果， 且膜定位較為清晰與準確； 而hPD-L220～123重組蛋白作為免疫原制備的多抗血清陽性染色較弱且定位模糊. 因此， 只有制備包含有胞外免疫球蛋白樣IgV結(jié)構(gòu)域和IgC結(jié)構(gòu)域的PD-L2重組蛋白作為抗原制備的抗體， 才能獲得較為準確的臨床診斷結(jié)果. 該研究結(jié)果不僅為hPD-L2蛋白的功能研究提供有用的抗體試劑， 也為建立快速、 高效的腫瘤診斷方法奠定一定的基礎.

參考文獻：

[1]OHAEGBULAM K C, ASSAL A, LAZAR-MOLNAR E,etal. Human cancer immunotherapy with antibodies to the PD-1 and PD-L1 pathway[J]. Trends in Molecular Medicine, 2015, 21(1): 24-33.

[2] JI M, LIU Y, LI Q,etal. PD-1/PD-L1 pathway in non-small-cell lung cancer and its relation with EGFR mutation[J]. Journal of Translational Medicine, 2015, 13(1): 5.

[3] MO Z F, LIU J, ZHANG Q Y,etal. Expression of PD-1, PD-L1 and PD-L2 is associated with differentiation status and histological type of endometrial cancer[J]. Oncology Letters, 2016, 12(2): 944-950.

[4] PARDOLL D M. Spinning molecular immunology into successful immunotherapy[J]. Nature Reviews Immunology, 2002, 2(4): 227-238.

[5] RITPRAJAK P, AZUMA M. Intrinsic and extrinsic control of expression of the immunoregulatory molecule PD-L1 in epithelial cells and squamous cell carcinoma[J]. Oral Oncology, 2015, 51(3): 221-228.

[6] TSENG S Y, OTSUJI M, GORSKI K,etal. B7-DC, a new dendritic cell molecule with potent costimulatory properties for T cells[J]. The Journal of Experimental Medicine. 2001, 193(7): 839-846.

[7] LATCHMAN Y, WOOD C R, CHEMOVA T,etal. PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation[J]. Nature Immunology, 2001, 2(3): 261-268.

[8] SHIN T, KENNEDY G, GORSKI K,etal. Cooperative B7-1/2 (CD80/CD86) and B7-DC costimulation of CD4+T cells independent of the PD-1 receptor[J]. The Journal of Experimental Medicine, 2003, 198(1): 31-38.

[9] LOKE P, ALLISON J P. PD-L1 and PD-L2 are differentially regulated by Th1 and Th2 cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003, 100(9): 5336-5341.

[10] OKAZAKI T, MAEDA A, NISHIMURA H,etal. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001, 98(24): 13866-13871.

[11] OKAZAKI T, HONJO T. The PD-1-PD-L pathway in immunological tolerance[J]. Trends in Immunology, 2006, 27(4): 195-201.

[12] SALISCH N C, KAUFMANN D E, AWAD A S,etal. Inhibitory TCR coreceptor PD-1 is a sensitive indicator of low-level replication of SIV and HIV-1[J]. The Journal of Immunology, 2010, 184(1): 476-487.

[13] RODR?GUEZ-GARC?A M, PORICHIS F, DE JONG O G,etal. Expression of PD-L1 and PD-L2 on human macrophages is up-regulated by HIV-1 and differentially modulated by IL-10[J]. Journal of Leukocyte Biology, 2011, 89(4): 507-515.

[14] LIANG S C, GREENWALD R J, LATCHMAN Y E,etal. PD-L1 and PD-L2 have distinct roles in regulating host immunity to cutaneous leishmaniasis[J]. Eur J Immunol, 2006, 36(1): 58-64.

[15] DONG Y, SUN Q, ZHANG X. PD-1 and its ligands are important immune checkpoints in cancer[J]. Oncotarget, 2017, 8(2): 2171-2186.

[16] 王小亞， 林齊心， 李妙君， 等. 表達Ki-67的CHO細胞用于制備免疫組織化學細胞質(zhì)量控制片[J]. 中華病理學雜志, 2014, 43(3): 189-191.

[17] 曹旭東, 孔令洪, 王一理. B7家族新成員[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2003, 19(4): 312-417.

[18] WOLCHOK J D, KLUGER H, CALLAHAN M K,etal. Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma[J]. The New England Journal of Medicine, 2013, 369(2): 122-133.

[19] KARIM R, JORDANOVA E S, PIERSMA S J,etal. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma[J]. Clinical Cancer Research, 2009, 15(20): 6341-6347.

[20] ROZALI E N, HATO S V, ROBINSON B W,etal. Programmed death ligand 2 in cancer-induced immune suppression[J]. Clinical & Developmental Immunology, 2015, 2012(2): 656340.