紫菜多酚對人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375增殖和誘導(dǎo)凋亡的影響及機(jī)制探討

邱小明， 李 鋒， 石賢愛

(1. 漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系， 福建 漳州 363000； 2. 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福建 福州 350116)

0 引言

紫菜屬于紅藻類紫菜屬， 其蛋白質(zhì)含量高(34.48%～37.21%)、 脂肪含量低(0.5%～2.09%)[1]， 富含多種氨基酸(35.48%)、 礦物質(zhì)元素和維生素(VC和β-胡蘿卜素)以及膳食纖維， 且多糖和多酚含量高[2-3]， 是理想的營養(yǎng)保健食品. 其中紫菜多酚具有抗氧化、 抗菌、 抗腫瘤、 降血脂[4-6]等多種生物活性.

本研究采用不同極性的有機(jī)溶劑對紫菜乙醇浸膏進(jìn)行提取分離， 并通過硅膠柱層析、 高效液相制備色譜等步驟得到紫菜多酚組分， 將其直接作用于人惡性黑色素瘤細(xì)胞A375， 并對其抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡作用機(jī)制進(jìn)行探討.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫菜購自福建漳浦； 人黑色素瘤細(xì)胞株A375購自中科院上海細(xì)胞研究所； DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司； 胎牛血清購自美國Hyclone公司； 胰蛋白酶購自美國Amresco公司； 二甲基亞砜(DMSO), 3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自美國Sigma公司； 48～75 μm硅膠購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； 6孔、 12孔、 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、 細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自美國Costar公司； 慶大霉素(活力單位為4×104U·mL-1)購自山東圣魯制藥有限公司； Annexin-V/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)公司； 其它化學(xué)試劑均為分析純， 購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱(NUAIR 550， 美國Nuaire公司)； 流式細(xì)胞儀(Coulter Epics XL， 美國Beckman公司)； 倒置光學(xué)顯微鏡(IDE2000， 重慶光電儀器有限公司)； 熒光全自動酶標(biāo)儀(SH-1000， 日本Corona公司)； 超低溫離心機(jī)(Z323K， 德國Hermle公司)； 自動分布收集器(BS-100A， 上海滬西有限公司)； 分析型高效液相色譜(1525 Binary Pump/2996 Photodiode Array Detector， 美國Waters公司)； 半制備型高相液相色譜(1525-2998/2414-2707-WFCI， 美國Waters公司 )； 超薄切片機(jī)(7650B， 日本日立公司).

1.3 紫菜多酚活性物質(zhì)的提取與分離

以經(jīng)干燥粉碎的紫菜粉末為出發(fā)物， 經(jīng)乙醇浸提得到濾液真空濃縮至粘液狀， 然后用石油醚萃取得下層水相層， 真空濃縮至浸膏狀， 冷凍干燥制得紫菜多酚粗提物A. 采用硅膠柱在乙酸乙酯/甲醇、 甲醇/水體系梯度洗脫條件下對乙醇粗提物A進(jìn)行梯度洗脫分離， 洗脫流速為0.5床層體積(BV)·h-1， 用30%(體積分?jǐn)?shù)， 以下同)乙酸乙酯/甲醇、 20%乙酸乙酯/甲醇、 10%乙酸乙酯/甲醇洗脫收集(83～122管處)其中的多酚組分， 經(jīng)濃縮冷凍干燥得紫菜多酚組分B. 再以乙腈和水為流動相， 采用ODS-BP色譜柱對組分B進(jìn)行分離， 梯度洗脫條件下分離得到組分C、 D1、 D2， 然后再次選擇乙腈和含0.1%乙酸的超純水作為流動相， 進(jìn)一步對組分C進(jìn)行分離， 梯度洗脫條件下分離得到組分C1、 C2.

1.4 多酚類物質(zhì)的測定方法

酚類物質(zhì)與福林酚試劑在堿性條件下氧化反應(yīng)生成蘭色的鎢鉬蘭復(fù)合物， 可用于酚類物質(zhì)的檢測. 根據(jù)該方法， 在760 nm波長下測定梯度質(zhì)量濃度下的沒食子酸溶液的吸光值， 得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=11.617x-0.010 5， 式中：x為沒食子酸終質(zhì)量濃度(mg·mL-1)；y為760 nm波長下測定的吸光值，R2=0.999 2， 線性關(guān)系較好.

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及MTT法測定組分對A375細(xì)胞增殖抑制作用

人皮膚黑色素瘤細(xì)胞A375， 用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、 青霉素100 mol·mL-1、 鏈霉素100 μg·mL-1)， 于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 每2 d傳代1次. 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中， 接種密度為104個(gè)·孔-1, 待細(xì)胞完全貼壁生長后， 加入終質(zhì)量濃度分別為30.000 0、 15.000 0、 7.500 0、 3.750 0、 1.875 0、 0.937 5 mg·mL-1的紫菜多酚樣品， 同時(shí)設(shè)置對照組， 各組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔， 培養(yǎng)48 h. 棄舊培養(yǎng)液， 每孔加入10 μL、 5 mg·mL-1的MTT， 繼續(xù)37 ℃孵育4 h棄上清液， 每孔加入100 μL DMSO， 37 ℃充分振蕩10 min， 于595 nm測定吸光度值， 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次， 計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制量(IC50). 以白藜蘆醇為陽性對照， 并計(jì)算出IC50值. 細(xì)胞生長抑制率計(jì)算公式如下.

1.6 A375細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)分為對照組和藥物組， 藥物組分別取紫菜多酚組分C1的質(zhì)量濃度為0.75、 1.50、 3.00 mg·mL-1， 作用48 h后倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化， 主要從細(xì)胞形狀、 皺縮程度、 細(xì)胞比例、 貼壁情況等多方面做出分析.

1.7 Annexin V-EGFP /PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

實(shí)驗(yàn)分為對照組和待測藥物組， A375細(xì)胞經(jīng)紫菜多酚組分C1處理48 h后， 用不含EDTA的胰酶分別消化收集后用PBS洗滌細(xì)胞2次， 1 200 r·min-1離心3 min， 收集1～5×105個(gè)細(xì)胞； 加入500 μL結(jié)合緩沖液將收集到的細(xì)胞懸浮起來； 加入5 μL Annexin V-EGFP染色劑混勻后， 加入5 μL PI染色劑， 兩者混勻； 室溫下放置， 避光反應(yīng)15 min； 用75 μm尼龍網(wǎng)對染色后的細(xì)胞進(jìn)行過濾； 流式細(xì)胞儀檢測， 計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞， 分析不同染色區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞比例.

1.8 酪氨酸酶活性的測定[7]

將對數(shù)生長期的A375細(xì)胞接種于6孔板上， 培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁后， 用終質(zhì)量濃度為3.000 0、 1.500 0、 0.750 0、 0.375 0、 0.187 5 mg·mL-1紫菜多酚組分C1處理細(xì)胞48 h. 然后用PBS洗滌細(xì)胞2次， 胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞， 1 200 r·min-1離心3 min， 收集細(xì)胞. 然后加入1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) tritonX-100的PBS溶液90 μL， 迅速置-80 ℃冰箱冷凍30 min. 于室溫下融化， 使細(xì)胞完全裂解， 37 ℃預(yù)溫后加入1 mg·mL-1左旋多巴10 μL， 37 ℃反應(yīng)60 min. 在490 nm測定吸光值. 同步按照節(jié)1.4的方法進(jìn)行MTT法測同樣藥物處理?xiàng)l件下A375細(xì)胞570 nm波長下的吸光值. 計(jì)算相對酪氨酸酶活力， 計(jì)算公式如下.

1.9 黑色素含量的測定[7]

將對數(shù)生長期的A375細(xì)胞接種于6孔板上， 培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁后， 用終質(zhì)量濃度為3.000 0、 1.500 0、 0.750 0、 0.375 0、 0.187 5 mg·mL-1紫菜多酚組分C1處理細(xì)胞48 h. 然后用PBS洗滌細(xì)胞2次， 胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞， 1 200 r·min-1離心3 min， 收集細(xì)胞. 加入1 mol·L-1NaOH溶液(含10% (體積分?jǐn)?shù))DMSO)1 mL， 充分溶解細(xì)胞， 室溫放置20 min. 波長400 nm測定吸光值， 換算為每106個(gè)細(xì)胞吸光度.

1.10 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的測定

用質(zhì)量濃度為0.187 5和1.500 0 mg·mL-1的紫菜多酚組分C1分別處理A375細(xì)胞24 h； 然后用胰酶消化A375細(xì)胞， 4 ℃， 1 000 r·min-1離心10 min離心收集細(xì)胞. 用2.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))戊二醛， 磷酸緩沖液配制固定2 h； 后用PBS漂洗3次， 每次15 min； 再用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鋨酸固定液固定1 h； PBS漂洗3次， 每次15 min. 梯度為30%(體積分?jǐn)?shù)， 以下同)乙醇、 50%乙醇、 70%乙醇、 80%乙醇、 90%乙醇分別脫水8 min， 100%乙醇脫水3次， 每次8 min. 純乙醇與包埋液體積比為1∶1.5， 室溫1 h； 純乙醇與包埋液體積比1∶3， 室溫2 h； 純樹脂浸透過夜； 純包埋液37 ℃， 4 h. 按如下順序固定化： 45 ℃烘箱內(nèi)12 h， 60 ℃烘箱內(nèi)48 h. 使用超薄切片機(jī)， 切為厚度為70 nm的薄片； 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色.

1.11 數(shù)據(jù)處理

采用Origin軟件單因素方差和 Tukey’s檢驗(yàn)，P<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表明差異極具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 結(jié)果用x±s表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 紫菜多酚活性組分的分離純化

紫菜粉末物在70%(體積分?jǐn)?shù)， 以下同)乙醇溶液、 60 ℃、 浸提1.5 h的條件下提取2次， 得紫菜多酚乙醇粗提物A， 然后采用乙酸乙酯/甲醇、 甲醇/水體系, 通過硅膠柱層析對組分A進(jìn)一步純化. 在30%乙酸乙酯/甲醇、 20%乙酸乙酯/甲醇、 10%乙酸乙酯/甲醇部位進(jìn)行收集(83～122管)， 得純度較高的多酚組分B. 以乙腈和水為流動相， 聯(lián)合ODS-BP柱和C4柱對組分B再次純化梯度洗脫條件下得組分C、 D1、 D2.

最后選擇流動相乙腈和含0.1%乙酸的超純水， 對組分C進(jìn)一步分離， 在梯度洗脫條件得組分C1、 C2. 經(jīng)HPLC分析, C1、 C2、 D1、 D2為單峰， 為純度較高組分, 如圖1所示.

圖1 組分檢測色譜圖Fig.1 Chromatograms of component

2.2 紫菜多酚組分C1、 C2抗腫瘤活性評價(jià)

用不同濃度多酚組分C1、 C2分別處理A375細(xì)胞48 h， 以白藜蘆醇為陽性對照， 用MTT法檢測組分C1、 C2對A375細(xì)胞增殖的抑制作用， 結(jié)果如圖2所示， 組分C1、 C2對A375細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的生長抑制. 組分C1對人黑色素瘤細(xì)胞A375的增殖抑制作用高于組分C2， 其IC50值分別為1.10、 1.58 mg·mL-1， 組分C1對A375細(xì)胞作用效果更明顯.

圖2 各組分對A375細(xì)胞生長的影響Fig.2 Effect of each component on inhibition ratio of A375 cell

2.3 紫菜多酚組分C1對A375細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響

分別用質(zhì)量濃度為0.75、 1.50、 3.00 mg·mL-1的紫菜多酚組分C1作用于A375細(xì)胞48 h， 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化， 結(jié)果如圖3所示. 對照組細(xì)胞生長迅速， 貼壁狀態(tài)良好， 光學(xué)顯微鏡下呈梭形. 隨著組分C1質(zhì)量濃度的增加， 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化， 梭形狀細(xì)胞逐漸減少， 細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓或固縮， 碎片增多. 當(dāng)藥物質(zhì)量濃度達(dá)到3.00 mg·mL-1時(shí)， 在顯微鏡下可見大量的懸浮細(xì)胞， 細(xì)胞形態(tài)明顯皺縮且數(shù)目明顯減少， 大部分細(xì)胞生長受到抑制.

圖3 紫菜多酚組分C1對A375形態(tài)學(xué)的影響Fig.3 Effect of component C1 on morphology of A375

2.4 Annexin V-EGFP/PI雙染法檢測A375細(xì)胞凋亡

圖4 不同質(zhì)量濃度組分C1誘導(dǎo)A375凋亡作用Fig.4 Induced apoptosis treated with different mass concentrations of component C1 upon A375

用Annexin V-EGFP/PI雙染方法測定不同濃度紫菜多酚組分C1作用48 h后對A375細(xì)胞凋亡的影響， 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖4所示. 結(jié)果表明， 0.5、 1.0、 2.0 mg·mL-1紫菜多酚組細(xì)胞凋亡率較空白組分別增加13.8%、 12.3%、 14.6%, 組分C1對A375細(xì)胞增殖抑制作用可能是通過誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn).

2.5 紫菜多酚組分C1對A375細(xì)胞增殖抑制作用的機(jī)制

黑色素是由黑色素細(xì)胞在酪氨酸酶的催化作用下經(jīng)一系列反應(yīng)生成， 其中酪氨酸酶是指導(dǎo)黑色素合成和代謝的核心酶[8]. 正常情況下， 在酪氨酸酶的催化作用下， 酪氨酸被羥化生成L-多巴， 并進(jìn)一步被氧化成多巴醌, 最后多巴醌經(jīng)一系列復(fù)雜的過程生成黑色素， 黑色素含量和酪氨酸酶活力是檢測A375細(xì)胞分化的重要指標(biāo)[7]. 因此從酪氨酸活力、 黑色素含量及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等3個(gè)指標(biāo)可以很好地表征A375是否發(fā)生細(xì)胞分化.

2.5.1 紫菜多酚組分C1對A375相對酪氨酸酶活性的影響

為進(jìn)一步探索組分C1對A375細(xì)胞增殖抑制作用的機(jī)制， 本研究用不同質(zhì)量濃度組分C1處理A375細(xì)胞48 h后， 檢測A375細(xì)胞裂解液中相對酪氨酸酶活力與其質(zhì)量濃度的關(guān)系如圖5所示. 當(dāng)組分C1的質(zhì)量濃度為3.000 0 mg·mL-1時(shí)， 細(xì)胞內(nèi)相對酪氨酸酶活力達(dá)到2.98， 是陰性對照組(1.15)的2.61倍， 具有顯著的差異性.

2.5.2 紫菜多酚組分C1對A375黑色素含量的影響

黑色素合成能力及酪氨酸酶的活力是反映A375瘤細(xì)胞分化能力的重要因素. 本實(shí)驗(yàn)采用NaOH裂解細(xì)胞， 測定400 nm處的吸光值(OD400 nm)， 折算成每106個(gè)細(xì)胞的OD400 nm值， 間接反映胞內(nèi)黑色素的含量. 紫菜多酚C1對A375細(xì)胞黑色素含量的影響如圖6所示， 當(dāng)組分C1的質(zhì)量濃度為3.000 0 mg·mL-1時(shí)， OD400 nm值(每106個(gè)細(xì)胞)達(dá)到0.239， 是陰性對照組(0.102)的2.34倍， 具有顯著的差異性.

圖5 組分C1對A375細(xì)胞酪氨酸酶活力的影響Fig.5 Effect of component C1 on tyrosine enzyme activity of A375 cell line

圖6 紫菜多酚C1對A375細(xì)胞黑色素含量的影響Fig.6 Effect of component C1 on melanin level of A375 cell line

2.5.3 紫菜多酚組分C1對A375細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

由節(jié)2.5.1和節(jié)2.5.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可初步判定組分C1具有誘導(dǎo)A375細(xì)胞向正常細(xì)胞分化的趨勢. 黑色素瘤細(xì)胞一旦出現(xiàn)分化趨勢， 除了黑色素含量和酪氨酸酶活力會發(fā)生改變外， 細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)也一定會發(fā)生相應(yīng)的變化[9-10]. 本研究用質(zhì)量濃度為0.187 5、 1.500 0 mg·mL-1的組分C1分別處理A375細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組， 不經(jīng)組分C1處理的細(xì)胞正常培養(yǎng)作為對照組， 采用透射電鏡進(jìn)一步觀察A375細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化， 結(jié)果如圖7所示. 經(jīng)組分C1處理后， A375細(xì)胞核體積明顯縮小， 細(xì)胞質(zhì)所占比例增大， 細(xì)胞器種類和數(shù)目明顯增多， 對照組細(xì)胞核飽滿、 充盈， 細(xì)胞器種類單一、 數(shù)目稀少. 結(jié)果表明隨著組分C1質(zhì)量濃度的增加， 細(xì)胞逐漸趨向良性分化， 在一定程度降低了A375細(xì)胞的惡性程度.

圖7 紫菜多酚組分C1對A375細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.7 Effect of component C1 on morphology change of A375 cell line

3 結(jié)語

多酚類物質(zhì)抗腫瘤活性的作用機(jī)理主要集中在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、 抑制細(xì)胞增殖、 誘導(dǎo)正常分化等方面[11-14]. 有研究表明多酚可直接作用殺死腫瘤細(xì)胞， 也可通過改變細(xì)胞周期發(fā)揮阻滯作用， 同時(shí)還有通過提高機(jī)體免疫能力及抗氧化活性來達(dá)到抑制腫瘤生長的作用[15].

本研究以紫菜為原料， 經(jīng)乙醇浸提、 硅膠樹脂柱層析、 聯(lián)合ODS-BP柱和C4柱高效液相色譜法等分離手段， 得到了一個(gè)對A375細(xì)胞具有較強(qiáng)抑制活性和誘導(dǎo)凋亡作用的紫菜多酚組分C1. 經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、 Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡等實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了C1組分對A375細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用， 且具有劑量依賴性. 紫菜多酚組分C1可顯著提高酪氨酸活力和增加黑色素含量， 透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化, 發(fā)現(xiàn)其具有誘導(dǎo)A375黑色素瘤細(xì)胞凋亡和分化的作用， 從而達(dá)到抗腫瘤效果.

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