腦膠質(zhì)瘤可變剪接調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

呂俊杰, 王科俊, 熊新炎, 袁翠玲, 湯秀麗, 任付賓

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 生物信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 哈爾濱 150081;2.哈爾濱工程大學(xué) 自動(dòng)化學(xué)院, 哈爾濱 150080)

可變剪接(alternative splicing, AS)現(xiàn)象廣泛存在于真核生物基因中，調(diào)控眾多關(guān)鍵的基因后轉(zhuǎn)錄過(guò)程。由于可變剪接與多種人類重大疾病，尤其是癌癥，有著很大的相關(guān)性，越來(lái)越受到廣大科研工作者的關(guān)注，對(duì)可變剪接調(diào)控機(jī)制的研究層面也越來(lái)越廣泛。最初研究數(shù)據(jù)來(lái)源于表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag, EST)，由于受測(cè)序深度不夠的限制，對(duì)可變剪接的研究只能停留在單個(gè)基因?qū)用嫔蟍1]；后來(lái)隨著cDNA 微陣列(cDNA microarray)技術(shù)的出現(xiàn)，人們估計(jì)大約有 60%的人類基因可能包含至少一個(gè)能夠發(fā)生可變剪接的可變外顯子(alternative exon)，但是由于對(duì)微量mRNA亞型的敏感性設(shè)計(jì)不足等限制，仍然缺乏在全基因組范圍內(nèi)對(duì)可變剪接的認(rèn)識(shí)[2]。近年來(lái)，隨著二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，不但使得在全基因組內(nèi)對(duì)可變剪接事件的研究成為可能，而且通過(guò)各組學(xué)數(shù)據(jù)之間的相互整合，對(duì)可變剪接的研究更為全面，更為系統(tǒng)，最新的研究發(fā)現(xiàn)人類基因約95%的外顯子都能夠產(chǎn)生可變剪接[3]?？勺兗艚诱{(diào)控機(jī)制的異常可能會(huì)導(dǎo)致癌癥[4]。腦膠質(zhì)瘤是腦惡性腫瘤之一，致死率非常高，術(shù)后存活率低。已有的研究表明，多種與膠質(zhì)瘤相關(guān)的基因、酶、離子通道等均受可變剪接的調(diào)控。本文綜述近年來(lái)腦膠質(zhì)瘤可變剪接調(diào)控機(jī)制研究的進(jìn)展，并對(duì)剪接層面的臨床治療進(jìn)行了展望。

1 pre-mRNA可變剪接調(diào)控機(jī)制

可變剪接又稱選擇性剪接，是調(diào)節(jié)真核生物pre-mRNA為成熟mRNA的關(guān)鍵過(guò)程。 可變剪接調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，剪接形式多樣，目前，經(jīng)典的分類方法將可變剪接形式分為7種類型，如圖1所示。其中，外顯子跳過(guò)是哺乳動(dòng)物中最常見(jiàn)的類型，約占人類可變剪接事件的38.4%，在這種模式中，外顯子與成熟的mRNA一起從側(cè)翼的內(nèi)含子中切除；可變5′/ 3′剪接位點(diǎn)也是比較常見(jiàn)的類型，分別約占可變剪接事件的7.9%和18.4%； 內(nèi)含子保留類型，顧名思義是指內(nèi)含子保留在所得的成熟mRNA中，約占可變剪接事件的2.8%。 其他類型的可變剪接包括互斥外顯子，可變初始外顯子，可變終末外顯子，這些剪接模式約占可變剪接事件的32.5%[5]。

調(diào)節(jié)可變剪接機(jī)制的基本元素有順式作用元件和反式作用因子。順式作用元件是指剪接一致序列和一些輔助元件，它們共同決定剪接的最終結(jié)果[6]；反式作用因子由一群富含絲氨酸/富含精氨酸(SR)蛋白，以及一些核糖核蛋白(hnRNP)和小核糖核蛋白(snRNP)構(gòu)成[7-10]。順式作用元件和反式作用因子相互作用，共同精確調(diào)節(jié)可變剪接的過(guò)程。關(guān)于各剪接調(diào)控元件及其作用機(jī)制的詳細(xì)介紹可以參考Black的綜述文章——Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing[11]。

圖1可變剪接主要類型[11]Fig 1 Main patterns of alternative splicing[11]

2 腦膠質(zhì)瘤中的可變剪接調(diào)控機(jī)制

2.1 癌癥與可變剪接

在正常組織分化期間，可變剪接調(diào)控精密，錯(cuò)誤的可變剪接可能導(dǎo)致產(chǎn)生異常的蛋白質(zhì)亞型，從而導(dǎo)致疾病甚至癌癥?；蚪M范圍內(nèi)研究表明[12]:超過(guò)15 000種腫瘤相關(guān)的剪接變體廣泛存在于癌癥中。計(jì)算分析腫瘤相關(guān)的剪接變體揭示出可變剪接參與癌細(xì)胞生物學(xué)的幾乎每個(gè)方面，包括增殖、分化、細(xì)胞周期控制、代謝、凋亡、運(yùn)動(dòng)、侵入和血管生成。在所選擇的剪接變體的功能篩選中，發(fā)現(xiàn)乳腺癌和/或卵巢癌特異性10%(41個(gè)測(cè)試中的4個(gè))可變剪接事件有助于癌細(xì)胞存活[13]。 盡管癌癥特異性可變剪接事件的功能意義還沒(méi)有被完全探索清楚，但是已有大量研究證實(shí)：異常可變剪接和癌癥之間有著密切的聯(lián)系。

異常的可變剪接事件經(jīng)常反映出剪接調(diào)控機(jī)制的異常，前體mRNA剪接一般由初級(jí)轉(zhuǎn)錄物中的順式作用剪接序列(順式作用元件)和結(jié)合這些RNA序列的反式剪接因子來(lái)調(diào)控[14]。蛋白質(zhì)水平的改變和剪接調(diào)節(jié)因子活性的改變，順式作用元件中的點(diǎn)突變以及剪接調(diào)控機(jī)制本身的核心組分中的突變，都可導(dǎo)致異?？勺兗艚拥陌l(fā)生，從而導(dǎo)致癌癥以及許多癌癥表型[15]。研究腫瘤中的pre-mRNA 可變剪接調(diào)控機(jī)制對(duì)腫瘤的臨床診斷及治療都非常重要。

2.2 腦膠質(zhì)瘤的可變剪接調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性

人類腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)類型惡性腫瘤，發(fā)病率占所有原發(fā)性腦腫瘤的60%以上，根據(jù)世界健康組織對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類，腦膠質(zhì)瘤被分為6類[16]：彌漫性星形細(xì)胞瘤(II級(jí))、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤(OD，II級(jí))、間變性星形細(xì)胞瘤(III級(jí))、間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤(III級(jí))、間變性少突星形細(xì)胞瘤(III級(jí))和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM，IV級(jí))，其中，GBM是最常見(jiàn)，最有侵襲性的原發(fā)性腦腫瘤，占惡性星形細(xì)胞瘤的80%。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤可原發(fā)于腦實(shí)質(zhì)內(nèi)，亦可呈繼發(fā)性。繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤多數(shù)由間變性星形細(xì)胞瘤進(jìn)一步惡變而來(lái)，少部分可由混合性膠質(zhì)瘤、少突膠質(zhì)瘤或室管膜瘤演變而成。雖然GBM被認(rèn)為主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)膠質(zhì)瘤，但是也有少部分GBM表現(xiàn)出OD樣腫瘤細(xì)胞分化。OD是在成人中觀察到的高分化，生長(zhǎng)緩慢，呈彌漫性浸潤(rùn)的腫瘤，并且通常位于腦半球中。盡管近年來(lái)神經(jīng)外科，化療和放射治療技術(shù)方面取得了快速的進(jìn)展，但是膠質(zhì)瘤通常預(yù)后效果不好。 因此，明確膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的基因通路十分必要。

已有研究表明：腫瘤特異性可變剪接在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中對(duì)基因表達(dá)和相關(guān)的蛋白質(zhì)功能起著重要的調(diào)控作用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種具有腫瘤特異性，同一腫瘤不同級(jí)別特異性的異?？勺兗艚愚D(zhuǎn)錄體，這些轉(zhuǎn)錄物已被作為疾病進(jìn)程的標(biāo)志物。多項(xiàng)研究表明[17-20]：腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和/或發(fā)展受異常剪接亞型的影響，例如：表皮生長(zhǎng)因子受體，磷酸酶和張力蛋白同源物，腫瘤蛋白p53(TP53)，增殖相關(guān)的Ki-67抗原，鼠mutS同源物，血小板衍生生長(zhǎng)因子α等這些剪接亞型的異常都和腦膠質(zhì)瘤有關(guān)?？勺兗艚拥漠惓：湍[瘤發(fā)生之間的關(guān)系已經(jīng)作為癌癥生物學(xué)的研究新方向。膠質(zhì)瘤中可變剪接基因的識(shí)別可以為膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供新的分子標(biāo)志物。然而，可能導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展的可變剪接相關(guān)的分子機(jī)制仍然不是十分清楚。所以，研究腦膠質(zhì)瘤的pre-mRNA 可變剪接調(diào)控機(jī)制對(duì)于臨床治療有著劃時(shí)代的意義。

腦膠質(zhì)瘤中發(fā)生可變剪接的基因數(shù)量很多，其調(diào)控機(jī)制受多種因素的影響，所以，想要基于單一數(shù)據(jù)對(duì)不同類型的膠質(zhì)瘤發(fā)生過(guò)程，甚至從同一種腫瘤的原發(fā)瘤和繼發(fā)瘤發(fā)生過(guò)程中分析研究腦膠質(zhì)瘤可變剪接，得出的結(jié)果中必然存在很大的假陽(yáng)性。要想對(duì)腦膠質(zhì)瘤的可變剪接調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入細(xì)致的研究，需要整合多組學(xué)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)地將可變剪接調(diào)控過(guò)程分析與定量分析結(jié)合起來(lái)，篩選出腫瘤形成中可變剪接的變化。隨著多組學(xué)數(shù)據(jù)的產(chǎn)生以及生物信息技術(shù)的不斷發(fā)展，我們對(duì)各類型膠質(zhì)瘤的發(fā)生以及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制將得到深層次的了解，為膠質(zhì)瘤的診斷治療提供更好的依據(jù)。

3 腦膠質(zhì)瘤可變剪接調(diào)控機(jī)制的研究策略

3.1 組學(xué)時(shí)代的可變剪接調(diào)控機(jī)制

目前，對(duì)于可變剪接調(diào)控機(jī)制的研究，已不局限于單個(gè)基因、單個(gè)細(xì)胞和單個(gè)器官的分析研究。隨著實(shí)驗(yàn)與計(jì)算生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)可變剪接的研究已進(jìn)入組學(xué)時(shí)代。對(duì)可變剪接與基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等組學(xué)的相互整合分析，可多方位系統(tǒng)研究可變剪接調(diào)控機(jī)制[21]?？勺兗艚涌墒筽re-mRNA產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄體，這些轉(zhuǎn)錄體經(jīng)過(guò)翻譯成為結(jié)構(gòu)、功能各不相同的蛋白亞型(isoform)。蛋白質(zhì)是機(jī)體功能的最終執(zhí)行者[22]，這樣可變剪接現(xiàn)象極大地?cái)U(kuò)增了生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)數(shù)量，同時(shí)也產(chǎn)生了很多原來(lái)蛋白質(zhì)不具備的功能，這些功能涉及細(xì)胞增殖與凋亡、免疫調(diào)節(jié)、急性炎癥響應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞再生及分化、膽固醇運(yùn)輸?shù)?，這迫使人們不得不以更加深入的眼光看待可變剪接這一過(guò)程，今后對(duì)于蛋白功能的研究必須從基因?qū)用嫦騺喰蛯用孢M(jìn)行深化。

3.2 多組學(xué)數(shù)據(jù)整合分析腦膠質(zhì)瘤可變剪接調(diào)控機(jī)制

以往的蛋白質(zhì)組質(zhì)譜技術(shù)對(duì)于同一種蛋白的不同亞型間的細(xì)小差別不能很好地區(qū)分，隨著組學(xué)時(shí)代的到來(lái)，以及測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其是二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，使得大量針對(duì)蛋白亞型特異性研究成為可能[23]。但是面對(duì)如此海量的信息，單分子或多分子研究顯然不能滿足研究的需要。為了在亞型層面上對(duì)蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行深入、系統(tǒng)、全面和大規(guī)模地研究，需要對(duì)多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析來(lái)建立大規(guī)模、高通量的蛋白質(zhì)亞型功能的研究方法。隨著深度測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，整合 RNA-Seq 數(shù)據(jù)與金標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)集的研究方法由于具有較高的準(zhǔn)確性和易行性而逐漸成為一種新興的研究手段，特別是海量 RNA-Seq 數(shù)據(jù)的不斷產(chǎn)出，為其提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。未來(lái)多組學(xué)數(shù)據(jù)整合分析將成為分析研究方法的主流。

疾病的發(fā)生與發(fā)展往往涉及多個(gè)層面的因素，包括基因表達(dá)、后轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)以及各種代謝網(wǎng)絡(luò)等不同層面的病理生理過(guò)程[24]。一個(gè)層面數(shù)據(jù)的改變很難解釋疾病的整個(gè)發(fā)生過(guò)程，通過(guò)多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析，可以有效去除單個(gè)層面的隨機(jī)事件，將有助于人們對(duì)疾病形成更加系統(tǒng)全面的認(rèn)識(shí)。不再局限于 RNA-Seq 數(shù)據(jù)，外顯子芯片、Chip-Seq數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、單核苷酸突變、蛋白的翻譯后修飾等大規(guī)模組學(xué)數(shù)據(jù)均可通過(guò)它們之間線性或非線性關(guān)系進(jìn)行相互整合，這將大大提高分析的精確性與準(zhǔn)確性，最終建成經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)健的分析模型。在分子層面上解釋疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，同時(shí)也在亞型的水平上，對(duì)蛋白質(zhì)-RNA互作網(wǎng)絡(luò)，蛋白質(zhì)-DNA互作網(wǎng)絡(luò)以及蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)等進(jìn)行全面的分析研究，并且對(duì)如長(zhǎng)非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)領(lǐng)域的研究也有重要的借鑒意義。

目前，在多組學(xué)數(shù)據(jù)整合分析研究重大疾病，尤其是癌癥已經(jīng)取得初步進(jìn)展。Fang等通過(guò)整合ChIP-seq技術(shù)，微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)以及microRNA 數(shù)據(jù)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的重要調(diào)控元件SOX2的反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了分析研究，取得了很好的效果[24]；Kmin-seok等整合mRNA數(shù)據(jù)與microRNA 數(shù)據(jù)，建立支持向量機(jī)模型(SVM)識(shí)別出診斷胰腺癌的多種生物標(biāo)記(biomarkers)[25]；Ping等通過(guò)整合多維基因組數(shù)據(jù)，包括DNA突變、拷貝數(shù)、甲基化、基因表達(dá)和miRNA表達(dá)譜，以及調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，確定基于多因素介導(dǎo)的失調(diào)網(wǎng)絡(luò)的驅(qū)動(dòng)模塊及其失調(diào)基因，識(shí)別出膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中17種基因及其失調(diào)基因的核酸模塊[26]。Agyeman 等將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與蛋白組數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，分析乳腺癌的潛在化學(xué)預(yù)防劑萊菔硫烷(SFN)的作用機(jī)理[27]；Szklarczyk等研究發(fā)現(xiàn)糖酵解過(guò)程和代謝組、蛋白組和基因組都相關(guān)[28]。這些研究都表明了疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程涉及眾多的細(xì)胞調(diào)控過(guò)程，是一個(gè)系統(tǒng)的、多方面因素相互影響協(xié)調(diào)的復(fù)雜過(guò)程。腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)發(fā)生十分復(fù)雜，存在pre-mRNA 可變剪接的基因較多[29]，單組學(xué)數(shù)據(jù)很難分析其可變剪接調(diào)控過(guò)程，通過(guò)基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀組等多個(gè)層面的數(shù)據(jù)之間線性或非線性關(guān)系等將它們聯(lián)系到一起，進(jìn)行多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析，這將是未來(lái)對(duì)腦膠質(zhì)瘤可變剪接調(diào)控機(jī)制研究的新方向。

4 展望

最后，由于數(shù)據(jù)來(lái)源的多樣性，可將來(lái)源于不同年齡、不同類型的膠質(zhì)瘤，或不同病理分型的膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，研究基因亞型水平的表達(dá)模式，進(jìn)而探求在特定狀態(tài)下基因亞型的表達(dá)差異及其所可能具有的功能及意義[30]。利用多組學(xué)數(shù)據(jù)整合分析研究，可以找出導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的異常可變剪接發(fā)生的生理病理過(guò)程，例如，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、腫瘤抑制基因、各種酶、離子通道、細(xì)胞表面受體等[31]。所幸的是，這些關(guān)鍵基因所發(fā)生的可變剪接除了作為膠質(zhì)瘤的誘發(fā)因素外，同時(shí)能夠作為臨床上的診斷或治療靶點(diǎn)，為膠質(zhì)瘤在可變剪接層面的治療提供新的思路。

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