miR-195-5p在結(jié)直腸癌和肺癌細胞中的功能差異性研究

汪楚翔，劉涵，張函槊

1.北京市第十五中學 高二七班，北京 100054;2.首都醫(yī)科大學附屬復興醫(yī)院 腫瘤科，北京100038；3.北京基石生命科技有限公司，北京 100195

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼小RNA，約22個核苷酸，通過堿基互補配對（完全配對或不完全配對）靶向mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR），直接降解mRNA或抑制翻譯，從而完成對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。，miRNA序列數(shù)據(jù)庫22.0（miRBase）目前收集到發(fā)夾前體序列38589條，成熟miRNA和miRNA*產(chǎn)物共48885條，形成了巨大的調(diào)控網(wǎng)絡。miRNA與許多生理病理過程密切相關(guān)，如生長發(fā)育、細胞分化、細胞凋亡、脂類代謝、激素分泌、腫瘤形成和病毒感染等。

miR-195序列首先發(fā)現(xiàn)于鼠基因，后經(jīng)同源序列預測在人類基因中得以驗證。hsa-miR-195位于染色體17pl3.1區(qū)，由7017615～7017701的堿基對構(gòu)成。miR-195是miR-15/16/195/424/497家族的重要成員，在多種疾病如癌癥、心力衰竭和精神分裂癥中發(fā)揮重要作用[1-2]。近年的靶標預測及實驗研究表明，miR-195可通過CCND3、FLT3、WEE1[3]、E2F2[4]、Bcl-2、BNDF[5]、Arl2[6]等靶點發(fā)揮作用。研究表明，miR-195具有抑制細胞周期轉(zhuǎn)換，促進細胞凋亡的普遍作用，所以miR-195容易被簡單地概括為一種抑癌因子，但事實可能并非如此。我們采用生物信息學和實驗生物學方法，比較了miR-195在結(jié)直腸癌和肺癌組織、細胞中的表達差異，并初步探討了miR-195在人結(jié)直腸癌和肺癌細胞中的功能差異。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌細胞系SW620、人肺癌細胞系A(chǔ)549、小鼠肺癌細胞系344SQ、小鼠結(jié)直腸癌細胞系MC38（中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞資源中心）；RMPI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipo?fectAMINE2000（Invitrogen公司）；miR-195-5p模擬物（廣州銳博公司）；Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠（康寧公司）；CCK-8試劑盒（上海碧云天公司）；All-in-OnemiRNAqRT-PCR檢測試劑盒（GeneCopoeia,公司）。

1.2 miRNA腫瘤組織表達分析

利用starBase泛癌分析平臺（http://starbase.sy?su.edu.cn/panCancer.php）挖掘來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的不同癌癥類型的miRNA表達譜。

1.3 細胞總RNA提取

細胞用1×PBS緩沖液漂洗2次，每孔加入1 mLTRIzol試劑，室溫裂解至細胞裂解物清亮；加入200μL氯仿，劇烈振蕩10s，室溫靜置5min；4℃、12000r/min離心15min；小心吸取上層水相移至新管，加等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置30min；4℃，12000r/min離心15min后見管底白色沉淀即為總RNA；吸棄上清，加入1 mL80%乙醇顛倒混勻；4℃、10000r/min離心15min；棄上清后室溫晾干，用DEPC水溶解沉淀；取適量RNA樣品，稀釋后用紫外分光光度計測定濃度，讀取D260nm/D280nm比值測定純度，電泳鑒定RNA的完整性。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

用All-in-OnemiRNAqRT-PCR檢測試劑盒分析miRNA相對含量。按照說明書步驟，用通用反轉(zhuǎn)錄引物（5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC TCACTATAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3′）將 2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄條件：反應總體積25 μL，37℃反應 60min，結(jié)束后再進行85℃、5min滅活處理），所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用滅菌水稀釋至1/20，采用特異上游引物（5′-CGCAGTAGCAGCAC AGA-3′）和通用下游引物（5′-GCGAGCACAGAA TTAATACGAC-3′）進行下游qPCR實驗，反應體積20 μL（PCR條件：95℃預變性 10min；95℃變性10s，58℃退火20s，72℃延伸10s，40個循環(huán)），U6作為內(nèi)參（U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCA GCACA-3′），通過 CT（2-ΔΔCt）方法分析 miRNA 相對含量。各組PCR均進行3孔重復。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

將細胞按2×105/mL的密度種于24孔板中，用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；用LipofectAMINE2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細胞；每孔取0.5μL轉(zhuǎn)染試劑和miRNA模擬物20pmol，分別稀釋于250μL無血清1640培養(yǎng)基中，輕彈混勻，室溫靜置5min；將稀釋好的轉(zhuǎn)染試劑加入miRNA稀釋物中，輕彈混勻，室溫靜置20min；將miRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物逐滴加入細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)4h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后提取總RNA用于miRNA定量檢測。

1.6 細胞增殖實驗

取對數(shù)生長期的細胞，制備單細胞懸液，以2×103/孔種于96孔板，37℃培養(yǎng) 24、48、72和96h后進行CCK-8檢測，即每孔加入10μLCCK-8，4h后在酶標儀上測定各孔的D450nm值，以時間為橫坐標、D450nm值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.7 細胞遷移實驗

取對數(shù)生長期的細胞，制備單細胞懸液，以5×105/孔接種于6孔板，37℃培養(yǎng)過夜后進行實驗處理。繼續(xù)培養(yǎng)24h，消化細胞制備單細胞懸液，稀釋至2×105/mL，每種細胞種3個小室，每個小室中加入200μL細胞，在24孔板中加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為下液，將Tran?swell小室放入孔中，繼續(xù)培養(yǎng)12～24h取出小室，用棉簽擦去小室內(nèi)表面未穿膜的細胞，甲醇固定15min，DAPI染核 10min，用PBS洗3次，于熒光顯微鏡下觀察，20×10視野下計數(shù)細胞，共計數(shù)5個視野，統(tǒng)計結(jié)果。

1.8 細胞侵襲實驗

將凍存于-80℃冰箱的Matrigel基質(zhì)膠于4℃過夜（24h），變成液態(tài)。取300μL無血清培養(yǎng)基，加入 60 μL（或 50 μg/室）Matrigel，4℃混勻，加入Transwell小室各100 μL（3個室），放入37℃培養(yǎng)箱中孵育4～5h，當出現(xiàn)白色層時說明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。其余步驟同細胞遷移實驗。

1.9 統(tǒng)計分析

用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用x±s表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗分析和方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-195-5p在肺癌和結(jié)腸癌組織中的表達差異

通過starBasev2.0中的Pan-CancerPlatform直接調(diào)用TCGA數(shù)據(jù)庫中有關(guān)miR-195-5p的miRNA-seq數(shù)據(jù)，并進行分析。數(shù)據(jù)中包括440例肺腺癌、332例肺鱗癌和314例結(jié)直腸癌樣本，均以相對應的正常組織為對照。結(jié)果（圖1）顯示，miR-195-5p在肺腺癌和肺鱗癌中的表達含量都低于正常組織，然而在結(jié)直腸癌中的相對含量卻高于正常對照。

圖1 通過starBase分析TCGA數(shù)據(jù)庫中miR-195-5p在肺癌與結(jié)直腸癌組織中的表達差異

2.2 miR-195-5p在肺癌和結(jié)腸癌細胞中的表達差異

進一步通過實時定量PCR檢測了miR-195-5p在肺癌和結(jié)直腸癌細胞中的相對表達含量。實驗采用了4種細胞，即人結(jié)直腸癌細胞SW620、人肺癌細胞A549、小鼠肺癌細胞344SQ和小鼠結(jié)直腸癌細胞MC38。結(jié)果顯示，無論在人還是小鼠的肺癌細胞中，miR-195-5p的相對含量均顯著低于對應的結(jié)直腸癌細胞（圖2）。miR-195-5p在肺癌和結(jié)直腸癌組織中的表達差異揭示了miR-195-5p在不同腫瘤中可能具有不同的甚至相反的生物學功能。

2.3 miR-195-5p對肺癌與結(jié)腸癌細胞的增殖調(diào)控

為了探討miR-195-5p在肺癌和結(jié)腸癌細胞中潛在的功能差異，我們首先檢測了miR-195-5p對2種腫瘤細胞的增殖影響。CCK-8檢測結(jié)果表明，miR-195-5p模擬物轉(zhuǎn)染A549及SW620細胞，與轉(zhuǎn)染無關(guān)對照miRNA（NCmiRNA）模擬物組相比，在72h后細胞增殖都發(fā)生明顯改變。有趣的是，miR-195-5p過表達后對2種腫瘤細胞的增殖產(chǎn)生了完全相反的效應，表現(xiàn)出抑制肺癌細胞但卻促進結(jié)直腸癌細胞的增殖（圖3）。

2.4 miR-195-5p對肺癌與結(jié)直腸癌細胞侵襲與遷移的調(diào)控

利用Transwell檢測了miR-195-5p對肺癌與結(jié)直腸癌細胞侵襲與遷移能力的影響。結(jié)果與增殖調(diào)控類似，miR-195-5p在2種腫瘤細胞中調(diào)控遷移與侵襲的能力迥異。與細胞遷移結(jié)果一致，miR-195-5p的過表達能夠抑制肺癌細胞A549的侵襲與遷移（圖4A），反過來促進結(jié)直腸癌細胞SW620的侵襲與遷移（圖4B）。

圖2 實時定量PCR檢測miR-195-5p在人肺癌細胞A549和人結(jié)直腸癌細胞SW620中的相對表達含量（**P＜0.01）

3 討論

隨著對miRNA研究的深入，越來越多的證據(jù)表明，在不同組織、器官、細胞類型和生長發(fā)育過程中，miRNA的表達譜有很大差異，揭示miRNA的表達具有時序特異性和組織特異性。每種miRNA針對的數(shù)個甚至上百個潛在靶基因，在不同的細胞或同一細胞的不同狀態(tài)下發(fā)揮功能性靶標的作用也有所不同[7]。這些研究結(jié)果不但說明miRNA及其靶標具有時空動態(tài)變化的特性，而且也提示miRNA在機體內(nèi)發(fā)揮作用的復雜性。

圖3 CCK-8法檢測miR-195-5p對人結(jié)直腸癌細胞SW620和人肺癌細胞A549增殖的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖4 Transwell法檢測miR-195-5p對人結(jié)直腸癌細胞SW620和人肺癌細胞A549遷移與侵襲的影響

本研究通過starBase調(diào)用TCGA數(shù)據(jù)庫，分析了miR-195-5p在結(jié)直腸癌（314例）和肺癌（646例）中的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-195-5p在結(jié)直腸癌中相對于正常組織是高表達的，而在肺癌中截然相反。隨后，我們通過結(jié)腸癌和肺癌細胞證實了miR-195-5p在表達上，以及細胞增殖、侵襲與遷移功能上的差異，揭示了miR-195-5p調(diào)控功能的復雜性。

同時有研究表明，miR-195-5p在其他腫瘤中的表達有高有低，在舌鱗狀細胞癌[8]、膀胱腫瘤[9]、原發(fā)性腹膜癌[10]、乳腺癌[11]、胃癌和肝細胞癌[12]中均表達下調(diào)，在替莫唑胺耐藥的膠質(zhì)細胞瘤[13]、腎上腺皮質(zhì)癌[14]、慢性淋巴細胞白血病[15]中表達上調(diào)。因此，miR-195在不同類型的腫瘤中表達不同，其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用，不能簡單地概括為一種抑癌因子或促癌因子，miR-195在腫瘤中的作用仍有待進一步研究。

參考文獻