干擾素β和γ基因修飾的人羊水間充質干細胞的制備

劉安琪 杜晶春 藍曉 陳柳池 徐霞

廣州醫(yī)科大學金域檢驗學院（廣州510182）

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是能夠從多種組織來源的基質細胞分離出來的一種具有分化潛能的干細胞，在骨髓中最先被發(fā)現，現在還可從臍帶、外周血、脂肪組織、骨骼肌、羊水等［1］組織中分離獲得。能夠分化為脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞等多種組織細胞。羊水來源的間充質干細胞具有發(fā)育階段原始、易于獲得、不涉及倫理問題等優(yōu)點。

干擾素（interferon，IFN）是由英國科學家Isaacs于1957年利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒干擾現象時首先發(fā)現的，是一類具有廣泛生物活性的細胞因子，具有抑制細胞分裂、調節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤等多種作用。可是干擾素在體內半衰期很短，全身給藥達到治療效果的干擾素劑量對機體器官的毒性相當大，因此限制了干擾素的廣泛應用。

MSCs易于體外擴增培養(yǎng)，具有天然免疫豁免特性以及向腫瘤細胞遷移的能力［2］，且易于被逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒等載體轉染。有文獻報道，慢病毒載體更適用于干細胞，其對分裂和非分裂細胞都具有感染能力［3］。因此，本實驗考慮用hIFN?β、hIFN?γ修飾人羊水間充質干細胞（human amniotic fluid derived mesenchymal stem cells，AFM?SCs），并成功實現其表達和分泌，從而為探索腫瘤的靶向基因治療提供合適的細胞載體。

1 材料與方法

1.1 細胞 人羊水來源間充質干細胞：在廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床產前診斷正常標本中收集羊水組織培養(yǎng)獲得。293FT細胞：購于中國科學院細胞庫。

1.2 試劑和儀器 試劑：低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、0.25%胰酶-0.2%EDTA均購自美國Gibco公司，Recombinant Human FGF?basic購自 PeproTech 公司，BIO?AMFTM?2 培養(yǎng)基購自以色列Biological Industries公司，Lipo?fectamine2000、opti?MEM 培養(yǎng)基購自美國 Invitro?gen，攜帶hIFN?β、hIFN?γ、EGFP基因的質粒購于廣州復能生物公司，Human Interferon Beta ELISA kit、Human IFN gamma ELISA kit購自Arigo公司，Cell Counting Kit 8購自日本同仁公司，流式分析用抗體購自BD公司。儀器：倒置相差顯微鏡（Leica），細胞成像儀（BioTek公司），流式分析儀（BECK?MAN公司），酶標儀（BioTek公司）。

1.3 方法

1.3.1 人羊水間充質干細胞的收集、培養(yǎng)和傳代擴增 通過羊膜腔穿刺術收集少量羊水組織，1 100 r/min離心5 min棄上清，用低糖DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，4 ng/mL rBFGF）將細胞重懸后鋪在25 cm2培養(yǎng)瓶中，再按3∶1比例加入BIO?AMFTM?2培養(yǎng)基，置37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5～7 d后用0.25%胰酶消化貼壁細胞，按1∶3傳代。待細胞融合達80%左右，再用胰酶消化，每3～4天傳代1次，連續(xù)傳代3代后即可獲得形態(tài)均一的間充質干細胞。

1.3.2 人羊水間充質干細胞的體外誘導分化 （1）成骨誘導分化：將傳代擴增后的第4代AFMSCs以2×104接種于6孔板，待細胞融合達到80%以上后，吸去孔內培養(yǎng)液，PBS洗3次，誘導組加入成骨誘導液，對照組每孔加入L?DMEM完全培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3天換1次誘導液，待誘導至第21天用茜素紅-S染色的方法對成骨誘導分化進行鑒定。（2）成脂誘導分化：按成骨誘導分化的方法接種細胞，誘導組首先加入成脂誘導液誘導3 d，再用脂肪保持液處理1 d，如此循環(huán)3次，最后用脂肪保持液處理7 d。對照組加入DMEM完全培養(yǎng)基，每隔3～4 d換液。用油紅O染色法對成脂分化進行鑒定。

1.3.3 細胞表面標志測定 細胞長滿后用0.25%胰酶消化，1 200 r/min離心3 min，棄上清，PBS緩沖液洗滌2次，均分至EP管，加入相應的熒光標記抗體，4℃避光孵育45 min，離心，PBS緩沖液洗去未標記抗體，用200 μL PBS重懸，流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34、CD44、CD105和HLA?ABC的表達。

1.3.4 細胞生長曲線繪制 取第7代培養(yǎng)的AFMSCs消化后鋪于96孔板孔內，1 000個細胞/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞貼壁狀態(tài)良好，用CCK?8試劑盒測細胞數量，每孔加10 μL試劑，反應30 min用酶標儀測490 nm處的吸光度。每隔一天測一次，共測5次，每次測3個孔，取平均值。

1.3.5 不同培養(yǎng)代數人羊水間充質干細胞染色體核型的比較 取生長狀態(tài)良好的第1代AFMSCs與傳代至第30代的AFMSCs各一瓶，送往廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院做染色體核型分析。

1.3.6 重組慢病毒顆粒的制備 轉染前2 d將293FT細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達70%～80%以上時，將培養(yǎng)基換成不含抗生素的H?DMEM培養(yǎng)基。配制以下混合液：A：0.5 μg表達質粒（EGFP、hIFN?β、hIFN?γ）+SL3/SL4/SL5各0.25 μg+250 μL Opti?MEM，輕柔混勻；B：6 μL Lipo 2000+250 μL Opti?MEM，輕柔混勻，室溫放置5 min；將B液加入A液，輕輕混勻，室溫孵育15 min后，逐滴加入到含293FT細胞的6孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中，6 h后換成無雙抗的H?DMEM培養(yǎng)基，48 h后收集富含慢病毒顆粒的培養(yǎng)上清。2 500 r/min離心2 min，除去細胞碎片后將含有病毒顆粒的上清液用0.45 μm濾器過濾，分裝至1.5 mL EP管中，-20℃保存。

1.3.7 重組慢病毒顆粒感染人羊水間充質干細胞 取第4或5代狀態(tài)較好的AFMSCs鋪于6孔板內，細胞生長至80%融合時，換成新鮮培養(yǎng)液，1孔為不加任何慢病毒顆粒的陰性對照，其余3孔分別加入事先制備好的EGFP（陽性對照）、hIFN?β、hIFN?γ（實驗組）慢病毒顆粒，感染12 h后換為DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，再次感染，連續(xù)感染2～3次達到較好效果，并觀察細胞狀態(tài)、熒光表達情況。

1.3.8 轉染后間充質干細胞的純化 在轉染后第四天開始用1～3 mg/L的嘌呤霉素進行篩選，一般要篩選3輪，篩選的同時根據細胞生長增殖情況傳代培養(yǎng)。

1.3.9 轉染后間充質干細胞的鑒定分析 經嘌呤霉素篩選的AFMSCs傳代至第4代時分別收集陰性對照組（AFMSCs）、陽性對照組（轉染EGFP）和實驗組（轉染hIFN?β、hIFN?γ）的培養(yǎng)基上清，按照ELISA試劑盒說明檢測上清液中hIFN?β、hIFN?γ的濃度。

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件，實驗數據中計量資料以±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人羊水間充質干細胞的形態(tài) 最初從羊水中分離得到的細胞在培養(yǎng)瓶中成懸浮狀態(tài)，原代培養(yǎng)5～7 d貼壁生長，早期貼壁細胞主要呈類上皮樣、梭形或三角形，傳代培養(yǎng)后細胞形態(tài)逐漸均一，多為成纖維樣。見圖1。

圖1 第4代人羊水間充質干細胞形態(tài)（×40）Fig.1 The morphology of the fourth generation of AFMSCs

2.2 人羊水間充質干細胞具有多向誘導分化能力 成骨誘導21 d，茜素紅染色可觀察到深褐色鈣沉積，見圖2A；成脂誘導19 d，油紅O染色可看到脂滴形成，見圖2B。

圖2 人羊水間充質干細胞體外誘導分化（×100）Fig.2 Induced differentiation in vitro of AFMSCs（× 100）

2.3 細胞表面標志測定 流式細胞儀分析結果顯示，AFMSCs不表達CD34，高表達CD44、CD105和HLA?ABC。見圖3。

2.4 人羊水間充質干細胞生長曲線 第7代細胞接種后，1 d貼壁，5 d內為緩慢生長期，5～7 d細胞進入對數生長期，7～9 d細胞達到生長平臺期。見圖4。

2.5 不同培養(yǎng)代數人羊水間充質干細胞染色體核型的比較 第1代AFMSCs（圖5A）與第30代AFM?SCs（圖5B）的核型比較結果顯示，染色體核型均為正常二倍體核型，染色體數目均為2n=46條，染色體G帶顯示清晰。

圖3 第4代人羊水間充質干細胞表面標志測定Fig.3 Surface marker determination of the fourth generation of AFMSCs

圖4 第7代人羊水間充質干細胞生長曲線Fig.4 Growth curve of the seventh generation of AFMSCs

圖5 人羊水間充質干細胞的的染色體（×1 000）Fig.5 The chromosome of AFMSCs（× 1 000）

2.6 慢病毒的包裝結果 在熒光顯微鏡下觀察，可見轉染EGFP組大量293FT細胞表達強綠色熒光，見圖6A，說明質粒轉染進入293FT細胞效率較高；同時293FT細胞在病毒作用下融合狀態(tài)較好，見圖6A，B，C，有利于病毒顆粒的組裝和釋放，收集培養(yǎng)基并離心后可獲得含病毒顆粒的上清液。

圖6 慢病毒包裝結果（bar：100 μm）Fig.6 Lentivirus packaged

2.7 慢病毒轉染人羊水間充質干細胞 能夠得到轉染效率較高的AFMSCs，目的基因在細胞內表達。EGFP組轉染2次后AFMSCs高表達EGFP，見圖7A。在轉染后第四天開始用嘌呤霉素進行篩選，經過3輪篩選得到穩(wěn)定表達hIFN?β、hIFN?γ的AFMSCs。

圖7 慢病毒轉染人羊水來源間充質干細胞（bar：200 μm）Fig.7 Lentivirus transfection of AFMSCs

2.8 干擾素β和γ修飾的人羊水間充質干細胞的鑒定 Elisa檢測結果顯示，對照組和EGFP組均無hIFN?β、hIFN?γ 表達，而hIFN?β 修飾的AFMSCs組中干擾素β濃度為1 830 pg/mL，hIFN?γ修飾的AFMSCs組中干擾素γ濃度為65.33 pg/mL，表明hIFN?β、hIFN?γ基因成功轉入AFMSCs中并高效表達，見圖8。

3 討論

關于MSCs的研究，標本多數從骨髓或脂肪組織中獲取，但從骨髓獲取MSCs對供體身體傷害相對較大，增殖分化潛能隨年齡增大而下降；脂肪組織中所含MSCs比例較少且增殖能力不強。本實驗從羊水中制備MSCs，具有取材相對方便和干細胞比例相對高的優(yōu)勢。目前認為MSCs沒有特異性的表面標志物，已有研究表明其具有上皮細胞和內皮細胞的特征，不表達造血干細胞的表面標志。本研究的流式結果與相關報道一致，同時AFMSCs可穩(wěn)定進行體外擴增，經過多次傳代仍未見明顯衰老痕跡且能保持正常核型；具有體外多向誘導分化能力。

圖8 Elisa檢測EFGP、hIFN?β和hIFN?γ修飾的AFMSCs表達hIFN?β、hIFN?γ的情況Fig.8 The expression of hIFN?β、hIFN?γ of AFMSCs modified by EFGP、hIFN?β和hIFN?γ

慢病毒顆粒的組裝需要病毒包裝質粒和表達質粒同時轉染293FT細胞，本實驗在轉染攜帶hIFN?β、hIFN?γ基因的表達質粒的同時，另一組轉染攜帶EGFP基因的表達質粒作為對照，因此根據綠色熒光蛋白表達情況可以判斷質粒的轉染效率及目的基因的表達效率。轉染實驗結果顯示，慢病毒質粒轉染后的293FT細胞融合狀態(tài)良好，轉染率較高，為高效感染AFMSCs提供了保證。感染實驗結果表明攜帶EGFP的慢病毒顆粒感染AFM?SCs后能表達較強的綠色熒光蛋白，ELISA結果表明感染了攜帶hIFN?β、hIFN?γ的慢病毒顆粒的AFMSCs能夠有效表達分泌型hIFN?β和hIFN?γ。

最近的研究結果表明MSCs輸注具有良好的安全性和耐受性［4］，結合 MSCs的歸巢特性［2］，MSCs作為細胞載體用于基因治療的研究已經在體外和動物水平取得了較好的效果［5］。如IL?12修飾的MSCs抑制卵巢癌細胞增殖并誘導其凋亡［6］；Trail修飾的神經干細胞可追蹤膠質瘤細胞，并可誘發(fā)其凋亡［7］；利用慢病毒包裝系統制備的色素上皮衍生因子修飾的MSCs在體內外實驗中均可抑制肝癌細胞生長和轉移的能力［8］。

干擾素療法作為腫瘤治療中的重要一員，已被用于骨髓瘤［9］、惡性淋巴瘤［10］和腎細胞癌［11］等多種腫瘤的治療。臨床Ⅱ期試驗證實靜脈注射高劑量的IFN?β對黑色素瘤可發(fā)揮抗腫瘤作用，但會產生副作用，如流感樣癥狀、疲勞、厭食癥等；而靜脈注射低劑量的干擾素在患者體內很快被降解，不能發(fā)揮抗腫瘤作用［12］。將AFMSCs用干擾素修飾后，高效表達干擾素的AFMSCs有望遷移到腫瘤部位，并在腫瘤部位大量表達目的基因，從而克服干擾素在臨床應用中半衰期短、需反復給藥以及大劑量給藥有副作用等缺點，有望靶向性治療腫瘤。干擾素除了具有抗腫瘤活性，還參與免疫調節(jié)。有文獻報道，NO是MSCs介導免疫抑制作用的關鍵效應分子［13-14］，IFN?β可通過降低Stat1與iNOS啟動子的結合來抑制MSCs產生NO，從而增強MSCs免疫反應并發(fā)揮抗腫瘤作用［15-16］；而IFN?γ則可以誘導MSCs生成NO，從而間接發(fā)揮免疫抑制作用并促進腫瘤生長［15］。因此，干擾素修飾的MSCs輸注體內后是否引起患者免疫功能的變化以及IFN?β和IFN?γ修飾的MSCs抗腫瘤作用的差異也有待研究。

本實驗成功制備出hIFN?β、hIFN?γ修飾的AFMSCs，為下一步將MSCs安全、高效地應用于腫瘤治療研究奠定了基礎。

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