脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4在乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制

毛英 黃湖南 王建榮 桂雄建 吳冰中國人民解放軍第一八四醫(yī)院普外科（江西鷹潭335000）；贛南醫(yī)學(xué)院解剖教研室（江西贛州34000）

乳腺癌的女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其高轉(zhuǎn)移性是導(dǎo)致病死率高的主要原因，因此進(jìn)一步探討其轉(zhuǎn)移的機(jī)制是乳腺癌治療的熱點(diǎn)問題［1-3］。脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4）是一類將脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到各種細(xì)胞間的脂肪素，是脂肪代謝的重要調(diào)節(jié)因子，研究還發(fā)現(xiàn)其可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)、細(xì)胞的增殖分化等［4-5］。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4是促進(jìn)宮頸癌［6］、肝癌［7］等細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的重要因素。新近的研究也發(fā)現(xiàn)FABP4與乳腺癌的增殖密切相關(guān)［8］，但其在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的具體作用和機(jī)制鮮有報道。因此本研究進(jìn)一步探討在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制，為乳腺癌的診治提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 Transwell小室（Corning公司，美國），F(xiàn)ABP4兔來源多克隆一抗（Abcam公司，美國），β?actin鼠來源單克隆一抗（CST公司，美國），抗兔或鼠HRP標(biāo)記二抗（中杉金橋，北京），高糖型DMEM、胎牛血清（Gibco公司，美國），胰蛋白酶（吉諾公司，中國），新霉素和嘌呤霉素（sigma，美國），IL?33中和抗體（R&D Systems，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞ZR?75?30，BT?474，T?470，MCF?7，BT549和MDA?MB?231 由本院實(shí)驗室保存細(xì)胞。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)。

1.3 免疫組化 收集我院2015年1月至2017年12月乳腺癌患者手術(shù)標(biāo)本的病理石蠟切片，其中未轉(zhuǎn)移癌28例、轉(zhuǎn)移癌41例。石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)、5%羊血清封閉、FABP4一抗（1∶200）4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記兔二抗室溫1 h，DAB顯色。染色評分參考MENG等［9］的方法。

1.4 干擾RNA（shRNA）轉(zhuǎn)染 shRNA由上海吉瑪生物公司合成，系列參考TANG等［10］的報道。MDA?MB?231細(xì)胞轉(zhuǎn)染按lip?2000的說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48 h，與新霉素0.2 μg/mL篩選，直至熒光顯微鏡下95%以上的細(xì)胞有熒光，Western blot檢測蛋白水平。

1.5 慢病毒過表達(dá) 過表達(dá)FABP4蛋白的慢病毒由上海和元生物公司合成。按慢病毒滴度和細(xì)胞比1∶50進(jìn)行轉(zhuǎn)染MCF?7細(xì)胞，48 h后給予嘌呤霉素（20 ng/mL）篩選，直至熒光顯微鏡下95%以上的細(xì)胞有熒光，Western blot檢測蛋白水平。

1.6 Western blot 提取全細(xì)胞蛋白，加入load?ing buffer后蛋白變性。SDS?PAGE膠分離蛋白（80 V，0.5 h后換100 V，1 h），轉(zhuǎn)膜（冰浴，90 V，1.5 h）。封閉（5% 脫脂奶粉，室溫，2 h），5%BSA稀釋FABP4、β?actin一抗（1∶1 000）4℃過夜孵育。二抗（1∶5 000）常溫1 h，TBST 洗膜后ECL顯影。

1.7 ELISA IL?33檢測參照eBioscience公司（美國）ELISA試劑盒說明進(jìn)行。

1.8 Transwell 50 mg/L Matrigel 1∶5稀釋液，50 μL包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。細(xì)胞消化后用無血清培養(yǎng)基DMEM制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL。吸取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室，下室加入含10%血清的DMEM 600 μL。18 h后取出小室，去除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定10 min后，結(jié)晶紫染色2 h，顯微鏡下拍照。

1.9 裸鼠轉(zhuǎn)移實(shí)驗 40只雌性BALC/c裸鼠購置南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗心中，參照南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗的要求，飼養(yǎng)我院SPF級動物房。20只雌性BALC/c裸鼠，5 × 106個MDA?MB?231鼠尾靜脈注射，隨機(jī)分為兩組，腹腔注射人源IL?33中和抗體（IL?33 nAb）10只及腹腔注射controlIgG（CtrlAb）10只。20只雌性BALC/c裸鼠，5 × 106個過表達(dá)FABP4的MCF?7細(xì)胞鼠尾靜脈注射，隨機(jī)分為兩組，腹腔注射人源IL?33中和抗體（IL?33 nAb）10只及腹腔注射control IgG（Ctrl Ab）10只。42 d后收集肺組織，石蠟包埋切片HE染色后，觀察每個肺葉切片的癌轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，采用One?way ANOVA方差分析法，首先利用Levene方法進(jìn)行方差齊性檢驗，確定方差齊性且整體比較組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義后進(jìn)一步作多重比較，多重比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FABP4在乳腺癌中的表達(dá)水平 筆者首先檢測了乳腺癌患者手術(shù)標(biāo)本石蠟切片中FABP4表達(dá)的水平，結(jié)果顯示與未轉(zhuǎn)移癌標(biāo)本相比，發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中FABP4表達(dá)顯著增加（圖1A）。同時，在高轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細(xì)胞ZR?75?30，BT549和MDA?MB?231胞漿蛋白和細(xì)胞培養(yǎng)基上清中FABP4表達(dá)都較低轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞BT?474，T?470和MCF?7的高（圖1B和C）。由此提示，高表達(dá)的FABP4與乳腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。

2.2 FABP4對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響 通過transwell實(shí)驗，筆者發(fā)現(xiàn)使用敲低高轉(zhuǎn)移性的MDA?MB?231細(xì)胞FABP4表達(dá)后，其轉(zhuǎn)移能力被明顯抑制（圖2A和B）；在低轉(zhuǎn)移的MCF?7細(xì)胞中加入過表達(dá)FABP4后，其轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)（圖2C和D）。由此可見，F(xiàn)ABP4可以促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移。

2.3 FABP4對乳腺癌細(xì)胞IL?33表達(dá)的影響 高轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞 ZR?75?30，BT549和MDA?MB?231細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IL?33表達(dá)都較低轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞BT?474，T?470和MCF?7的顯著增多（圖3A）。敲低FABP4的MDA?MB?231細(xì)胞，其IL?33分泌明顯減少（圖3B）；而在過表達(dá)FABP4的MCD?7培養(yǎng)基上清中，IL?33顯著減少（圖3C）。由此可見，F(xiàn)ABP4可以促進(jìn)IL?33的合成分泌。

2.4 IL?33在FABP4促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用 首先用IL?33中和抗體阻斷高轉(zhuǎn)移的MDA?MB?231細(xì)胞分泌的IL?33，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)移能力被明顯抑制（圖4A和C）；同時，筆者也觀察到在過表達(dá)FABP4的MCF?7細(xì)胞其轉(zhuǎn)移能力也能被IL?33中和抗體抑制（圖4B和D）。由此提示：FABP4可能是通過增加乳腺癌細(xì)胞分泌IL?33進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移。

圖1 FABP4在乳腺癌中的表達(dá)水平Fig.1 The expression of FABP4 in breast cancer

圖2 FABP4對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響Fig.2 The effect of FABP4 on breast cancer metastasis

圖3 FABP4對乳腺癌細(xì)胞IL?33表達(dá)的影響Fig.3 The effect of FABP4 on IL?33 expression of breast cancer cells

圖4 IL?33在FABP4促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用Fig.4 The effect of IL?33 on FABP4 induced breast cancer metastasis

3 討論

FABP4是一類重要的脂類伴侶，在脂質(zhì)介導(dǎo)的細(xì)胞生理過程和代謝中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4非小細(xì)胞肺癌［11］、胰腺導(dǎo)管癌［12］等的疾病進(jìn)展有非常密切的關(guān)系；進(jìn)一步的也發(fā)現(xiàn)FABP4可通過促進(jìn)EMT等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲［6］。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖；但體外實(shí)驗中，運(yùn)用重組的FABP4未發(fā)現(xiàn)其可以顯著促進(jìn)乳腺細(xì)胞遷移［8］。但在本研究中，通過對比臨床患者手術(shù)標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者乳腺癌組織中FABP4表達(dá)較未發(fā)生轉(zhuǎn)移的顯著增多；高轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞中FAPB4表達(dá)和分泌都較低轉(zhuǎn)移的多；進(jìn)一步，在敲低高轉(zhuǎn)移能力的MDA?MB?231的FAPB4表達(dá)，可以抑制其侵襲轉(zhuǎn)移；而在低轉(zhuǎn)移能力的MCF?7細(xì)胞過表達(dá)FAPB4，可促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移。

為什么有如此的差異呢？對比XIE等［6］宮頸癌中的研究，MASANA等使用的eFAPB4只有100 ng/mL，而XIE等在100 ng/mL也未發(fā)現(xiàn)其有促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，在500 ng/mL中的作用非常明顯。結(jié)合本研究結(jié)果，認(rèn)為FABP4有促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用。

腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有重要的作用，現(xiàn)有研究已經(jīng)表明腫瘤組織周圍的炎癥因子如IL?1、IL?6、CXCL9等可以促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移［13］。IL?33是一類IL?1家族細(xì)胞因子，其與炎癥反應(yīng)［14］、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?5］、纖維化［15］和腫瘤［17］等都有密切的關(guān)系。在乳腺癌研究中，發(fā)現(xiàn) IL?33 可以促進(jìn)乳腺癌的增殖［18］、EMT［19］、腫瘤耐藥［20］等。筆者也觀察到在高轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞中IL?33表達(dá)顯著增高。并且，敲低FABP4表達(dá)后，MDA?MB?231細(xì)胞分泌IL?33減少；而過表達(dá)FABP4的MCF?7細(xì)胞，IL?33分泌增加。也有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4 有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用［10，21］。由此可見，F(xiàn)ABP4可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞IL?33的分泌。那么，F(xiàn)ABP4是否通過IL?33來調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移？使用IL?33中和抗體后，F(xiàn)ABP4促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的能力被顯著抑制。

綜上所述，筆者認(rèn)為FABP4可以促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移，其機(jī)制與調(diào)控IL?33的表達(dá)有關(guān)。這可以為乳腺癌的防治提供新的靶點(diǎn)。但FABP4是如何調(diào)控IL?33表達(dá)分泌的還需要進(jìn)一步探討。

［1］ ZHANG Z，F(xiàn)AN Y，XIE F，et al.Breast cancer metastasis sup?pressor OTUD1 deubiquitinates SMAD7［J］.Nat Commun，2017，8（1）：2116.

［2］ VALASTYAN S，WEINBERG R A.Tumor metastasis：molecu?lar insights and evolving paradigms［J］.Cell，2011，147（2）：275?292.

［3］ 谷依學(xué)，賈小婷，羅利云，等.FGF2通過活化Akt?mTOR信號促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞化療耐受［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2017，33（1）：36?40.

［4］ NIEMAN K M，ROMERO I L，Van HOUTEN B，et al.Adi?pose tissue and adipocytes support tumorigenesis and metastasis［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1831（10）：1533?1541.

［5］ HOTAMISLIGIL G S，BERNLOHR D A.Metabolic functions of FABPs??mechanisms and therapeutic implications［J］.Nat Rev Endocrinol，2015，11（10）：592?605.

［6］ JIN J，ZHANG Z，ZHANG S，et al.Fatty acid binding protein 4 promotes epithelial?mesenchymal transition in cervical squa?mous cell carcinoma through AKT/GSK3beta/Snail signaling pathway［J］.Mol Cell Endocrinol，2017.

［7］ THOMPSON K J，AUSTIN R G，NAZARI S S，et al.Altered fatty acid binding protein 4（FABP4）expression and function in human and animal models of hepatocellular carcinoma［J］.Liver Int，2017.

［8］ GUAITA?ESTERUELAS S，BOSQUET A，SAAVEDRA P，et al.Exogenous FABP4 increases breast cancer cell proliferation and activates the expression of fatty acid transport proteins［J］.Mol Carcinog，2017，56（1）：208?217.

［9］ YU C，TANG W，WANG Y，et al.Downregulation of ACE2/Ang?（1?7）/Mas axis promotes breast cancer metastasis by en?hancing store?operated calcium entry［J］.Cancer Lett，2016，376（2）：268?277.

［10］WANG Q，SHI G，TENG Y，et al.Successful reduction of in?flammatory responses and arachidonic acid?cyclooxygenase 2 pathway in human pulmonary artery endothelial cells by silenc?ing adipocyte fatty acid?binding protein［J］.J Inflamm（Lond），2017，14：8.

［11］TANG Z，SHEN Q，XIE H，et al.Elevated expression of FABP3 and FABP4 cooperatively correlates with poor prognosis in non?small cell lung cancer（NSCLC）［J］.Oncotarget，2016，7（29）：46253?46262.

［12］LUO Y，YANG Z，LI D，et al.LDHB and FABP4 are associat?ed with progression and poor prognosis of pancreatic ductal ade?nocarcinomas［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2017，25（5）：351?357.

［13］HAABETH O A，LORVIK K B，HAMMARSTROM C，et al.Inflammation driven by tumour?specific Th1 cells protects against B?cell cancer［J］.Nat Commun，2011，2：240.

［14］SCHWARTZ C，O′GRADY K，LAVELLE E C，et al.Interleu?kin 33：an innate alarm for adaptive responses beyond Th2 im?munity?emerging roles in obesity，intestinal inflammation，and cancer［J］.Eur J Immunol，2016，46（5）：1091?1100.

［15］LIEW F Y，GIRARD J P，TURNQUIST H R.Interleukin?33 in health and disease［J］.Nat Rev Immunol，2016，16（11）：676?689.

［16］SUN Z，CHANG B，GAO M，et al.IL?33?ST2 Axis in liver dis?ease：progression and challenge［J］.Mediators Inflamm，2017，2017：5314213.

［17］WASMER M H，KREBS P.The role of IL?33?dependent inflam?mation in the tumor microenvironment［J］.Front Immunol，2016，7：682.

［18］MILOSAVLJEVIC M Z，JOVANOVIC I P，PEJNOVIC N N，et al.Deletion of IL?33R attenuates VEGF expression and enhanc?es necrosis in mammary carcinoma［J］.Oncotarget，2016，7（14）：18106?18115.

［19］KIM J Y，LIM S C，KIM G，et al.Interleukin?33/ST2 axis pro?motes epithelial cell transformation and breast tumorigenesis via upregulation of COT activity［J］.Oncogene，2015，34（38）：4928?4938.

［20］HU H，SUN J，WANG C，et al.IL?33 facilitates endocrine re?sistance of breast cancer by inducing cancer stem cell properties［J］.Biochem Biophys Res Commun，2017，485（3）：643?650.

［21］STEEN K A，XU H，BERNLOHR D A.FABP4/aP2 Regulates macrophage redox signaling and inflammasome activation via control of UCP2［J］.Mol Cell Biol，2017，37（2）.