基因HLA?DR13、CW1及A24表達(dá)、BCP突變與HBV感染者性別的相關(guān)性

楊小蓉 秦建川 馮致婷 黃演婷 王衛(wèi)闖

廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1檢驗(yàn)科，2病理科（廣州510080）

乙型肝炎病毒（HBV）感染后宿主會(huì)出現(xiàn)一系列不同的結(jié)局：如急慢性肝炎、攜帶者、肝硬化、肝癌［1］或者自動(dòng)清除病毒并產(chǎn)生保護(hù)性抗體。絕大多數(shù)流行病學(xué)研究表明，HBV感染后存在明顯的性別差異，在無(wú)癥狀攜帶者中的男女比例為1.2∶1，慢性肝炎為2.1∶1，重型肝炎肝硬化患者為（3.5 ～ 5.0）∶1，肝細(xì)胞癌為6.9∶1［2］。與HBV感染后結(jié)局相關(guān)的宿主基因HLA?DR13、HLA?A24、HLA?CW1表達(dá)、BCP基因突變、T淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+比值在不同性別人群的相關(guān)研究，目前鮮有報(bào)道。筆者在前期研究基礎(chǔ)［3］之上，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)患者血液中白細(xì)胞HLA?DR13、CW1及A24基因水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+表達(dá)，測(cè)序法檢測(cè)樣本基本核心啟動(dòng)子（BCP）變異，并分析相關(guān)因素與不同性別的人群中的差異表達(dá)之間的相關(guān)性，為下一步性激素受體信號(hào)通路在HBV感染后的作用研究打下基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇在2011年4月至2012年4月來(lái)廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的215例HBV感染者，其中女性感染組42例，男性感染組40例；女性自動(dòng)恢復(fù)組65例，男性自動(dòng)恢復(fù)組68例。男108例，女107例，年齡15～81歲，平均（44±4.4）歲；均排除HAV、HCV、HDV及HEV感染，排除EBV、CMV感染，排除自身免疫性肝病、酒精性肝病及脂肪肝。診斷符合2005年第六次全國(guó)傳染病與寄生蟲(chóng)病會(huì)議修訂的《病毒性肝炎防治指南》標(biāo)準(zhǔn)［4］。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 抽取患者靜脈血3 mL，分離血清，用于BCP檢測(cè)；抽取EDTA?Na抗凝全血2 mL，運(yùn)用酚-氯仿-異戊醇方法提取白細(xì)胞中DNA，用于檢測(cè)HLA?DR13、CW1及A24基因表達(dá)備用，并運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞。

1.2.2 FCM檢測(cè)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞 試驗(yàn)所用流式細(xì)胞儀、免疫熒光標(biāo)記抗體均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。在專(zhuān)用流式檢測(cè)管（FACS管）中首先加入單克隆抗體 CD4?FITC/CD8?PE/CD3?PE?Cys 2 μL，加入25 μL EDTA?Na抗凝混勻全血，混勻后避光孵育30 min后加入溶血素500 μL，混勻后室溫避光溶血15 min，用2 mL PBS洗液洗滌，混勻后離心（1 500 r/min，5 min），棄上清液后重復(fù)一次洗滌程序。最后加入500 μL PBS洗液，混勻后避光放置，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 檢測(cè)HLA?DR13、A24*1、CW1基因表達(dá)引物合成及測(cè)序均在上海生物工程公司完成，電泳儀為北京六一儀器廠，pMD載體為日本TAKARA公司產(chǎn)品，在HLA?DR13、A24*1、CW1序列（Genbank登錄號(hào)：HSU58978、AH004915.2、AH011749.2）CDS區(qū)域設(shè)計(jì) 3 對(duì)引物：5′?CCTGGACAGATACTTC?CATAACCA?3′，5′?TCGTCTTCCAGGATGTCCTTCT?3′［3］；5′?AGGTATTTCT CCACATCCGTGTCC?3′，5′?CTTTCCCTGTCTCCTCGTCCC?3′；5′?CGCTTCATCT?CAGTGGGCTACG?3′，5′?GCTCACTCGGTCAGTCT?GTGCC?3′。普通PCR擴(kuò)增出135、184、171 bp的片段后，連接，轉(zhuǎn)化，測(cè)序，酶切鑒定后，連接載體pMD20，按照104～107copies/mL稀釋倍數(shù)稀釋?zhuān)瑢?shí)時(shí)熒光定量PCT檢測(cè)各稀釋倍數(shù)質(zhì)粒（反應(yīng)條件：95℃變性30 s，95℃ 5 s，60℃退火30 s，30個(gè)循環(huán)）。最后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)各組HLA?DR13、A24和CW1基因表達(dá)量。

1.2.4 擴(kuò)增BCP序列 運(yùn)用等位基因擴(kuò)增方法，在HBV的X基因BCP序列（Genbank登錄號(hào)：NC_003977）BCP1762/1764突變位點(diǎn)處設(shè)計(jì)3個(gè)引物：5′?AATGGTCTTTGTACTAGGAG?3′，5′?AAAGATC?TTTGTACTAGGAG?3′，5′?ATGTTCCGGAGACTCTA?AG?3′，擴(kuò)增出312 bp的片段，以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送公司測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 17.0分析，所有的定量值均以log10對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，計(jì)量資料組間差異比較用方差分析，陽(yáng)性率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HLA?DR13、A24*1及CW1定量結(jié)果比較 HLA?DR13以男性HBV感染組最低，與女性感染組及男、女自動(dòng)清除組結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009，0.032，0.004，P＜ 0.05），而女性HBV感染組及男、女自動(dòng)清除組HLA?DR13表達(dá)量較高，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；4組HLA?A24和HLA?ACW1的結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 4組病例HLA?DR13、HLA?A24及HLA?CW1基因real?time PCR定量結(jié)果比較Tab.1 Comparison of HLA?DR13，HLA?A24 and HLA?CW1 levels among four groups ±s

表1 4組病例HLA?DR13、HLA?A24及HLA?CW1基因real?time PCR定量結(jié)果比較Tab.1 Comparison of HLA?DR13，HLA?A24 and HLA?CW1 levels among four groups ±s

注：與其他3組比較，*P＜0.05

組別HBV感染組(女性）HBV感染組（男性）HBV自動(dòng)清除組（女性）HBV自動(dòng)清除組（男性）例數(shù)42 40 65 68 HLA?DR13 2.72±1.86 1.76±1.02*2.69±2.10 2.56±1.68 HLA?A24 2.30±1.82 2.26±1.90 2.22±1.63 2.13±1.67 HLA?CW1 2.16±1.95 2.25±1.80 2.31±1.87 2.20±1.64

2.2 各組T細(xì)胞亞群結(jié)果 以男性HBV感染組CD3+CD4+T細(xì)胞百分率最低，與其他3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），男女自動(dòng)清除組顯著大于男女感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；4組CD8+T細(xì)胞百分率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；以女性HBV感染組CD4+/CD8+結(jié)果最低，男性HBV感染組其次，男女HBV感染組與男女自動(dòng)清除組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組T細(xì)胞CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD4+/CD8+結(jié)果比較Tab.2 Comparison of CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+/CD8+results among four groups ±s，%

表2 各組T細(xì)胞CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD4+/CD8+結(jié)果比較Tab.2 Comparison of CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+/CD8+results among four groups ±s，%

注：與其他3組比較，*P＜0.05

組別HBV感染組（女性）HBV感染組（男性）HBV自動(dòng)清除組（女性）HBV自動(dòng)清除組（男性）例數(shù)42 40 65 68 CD3+CD4+34.15±9.09*31.63±9.20*39.72±7.02 39.69±6.68 CD3+CD8+26.99±7.88 24.82±9.05 21.50±3.82 22.35±4.69 CD4+/CD8+1.39±0.61*1.47±0.77*1.88±0.38 1.82±0.37

2.3 4組各檢測(cè)項(xiàng)目相關(guān)性比較 HLA?DR13與HLA?A24及CD4+結(jié)果呈顯著正相關(guān)（P＜ 0.05），HLA?A24與HLA?CW1呈顯著正相關(guān)（r=0.42，P=0.000），CD4+T細(xì)胞結(jié)果與CD4+/CD8+呈顯著正相關(guān)（r=0.60，P=0.000），CD8+T細(xì)胞結(jié)果與CD4+/CD8+呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.71，P=0.000），見(jiàn)表3。

表3 各組HLA?DR13、A24、CW1、CD4+、CD4+/CD8+之間相關(guān)性Tab.3 Association of HLA?DR13，A24 CW1，CD4+，CD4+/CD8+results

2.4 BCP電泳及測(cè)序結(jié)果 運(yùn)用等位基因擴(kuò)增PCR法，擴(kuò)增出312 bp片段，見(jiàn)圖1。測(cè)序后男女陽(yáng)性率比較結(jié)果見(jiàn)圖2，女性HBV感染組BCP突變率為0.24（10/42），且全部為單突變，而男性HBV感染組突變率為0.19（13/68），其中單突變?yōu)?.16（11/68），雙突變?yōu)?.03（2/68），與女性HBV感染組結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 HBV感染組BCP突變電泳圖Fig.1 Electrophoresis map of BCP gene mutation in patients with HBV infection

圖2 男女BCP突變率的比較Fig.2 Comparison of the ratio of BCP gene mutation in male and female

3 討論

慢性HBV感染后的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多種因素合力作用的結(jié)果，除了環(huán)境和病毒的相互作用外，疾病的最終轉(zhuǎn)歸主要取決于宿主的免疫功能狀態(tài)，與遺傳相關(guān)的免疫因素可能是導(dǎo)致HBV相關(guān)肝臟疾病的主要機(jī)制［5］。人類(lèi)白細(xì)胞抗原（HLA）基因復(fù)合體所表達(dá)的基因產(chǎn)物，除直接構(gòu)成異體移植排斥反應(yīng)的靶抗原外，在免疫應(yīng)答的過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用，也反映了自身免疫性疾病的基因易感性［6］，與HBV感染后臨床結(jié)局密切相關(guān)，ALBAYRAK 等［7］的研究表明：接種乙肝疫苗后，非應(yīng)答者的HLA?A24及HLA?A11頻率顯著高于乙肝疫苗有應(yīng)答者，而非應(yīng)答者的HLA?CW6的頻率顯著低于乙肝疫苗有應(yīng)答者。HBV感染后的發(fā)展結(jié)局有明顯的性別差異，流行病學(xué)研究［8］表明，在感染HBV后發(fā)展為肝癌的男性約為女性的3倍。本研究中，將82例HBV感染后的患者分為男性組和女性組，將133例自動(dòng)清除HBV者根據(jù)性別分為男性和女性組，通過(guò)熒光定量PCR分析，HLA?DR13以男性HBV感染組最低，與女性感染組及男、女自動(dòng)清除組結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），4組HLA?A24和HLA?CW1的結(jié)果之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)了 HLA?DR13基因及 CD4+、CD4+/CD8+之間屬于正相關(guān)關(guān)系，而男女感染組與男女自動(dòng)清除組的CD4+及CD4+/CD8之值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在感染HBV后，機(jī)體主要以3種途徑清除病毒：（1）T淋巴細(xì)胞CD8+CTL直接殺滅途徑；（2）CTL直接誘導(dǎo)表達(dá)呈遞病毒抗原的肝細(xì)胞凋亡；（3）CTL產(chǎn)生和分泌非細(xì)胞毒性淋巴因子，抑制病毒基因的表達(dá)和病毒基因組的復(fù)制，從而干擾病毒的生活周期；HLA?DR屬于HLAⅡ類(lèi)分子，在機(jī)體對(duì)HBV的免疫應(yīng)答過(guò)程中，肝組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞可以表達(dá)高水平的高效遞呈病毒抗原給HLAⅡ類(lèi)分子限制的CD4+T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞的主要作用是通過(guò)分化成不同的細(xì)胞群而間接調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答［9］，如果肝組織受到損傷導(dǎo)致CD4+表達(dá)量不足，影響CD4+T細(xì)胞被激活，進(jìn)而影響到分化的Th1和Th2細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞免疫和體液免疫途徑受到影響，對(duì)人肝細(xì)胞移植（HUHEP）小鼠模型的研究結(jié)果表明，HBV感染的小鼠炎癥及免疫抑制細(xì)胞因子程度與肝內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，病毒載量高的小鼠會(huì)引起肝臟祖細(xì)胞的感染，這可能是導(dǎo)致肝癌發(fā)生的新機(jī)制［10］。由此可見(jiàn)，在本研究中HLA?DR13與CD4+T細(xì)胞表達(dá)呈正相關(guān)，也可能是HLA?DR13遞呈的HBV核心抗原可誘導(dǎo)更為強(qiáng)烈的CD4+T細(xì)胞增殖反應(yīng)，進(jìn)而影響到乙型肝炎病毒感染宿主后能否自動(dòng)被清除。HLA?A24與HLA?DR13及CW1呈正相關(guān)關(guān)系，但是在4組比較中均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與HLA?A24與乙肝疫苗的反應(yīng)性有關(guān)，而HLA?CW1則與臨床抗病毒治療后的療效相關(guān)［11］。

HBV為嗜肝病毒，為雙鏈DNA，病毒在復(fù)制的時(shí)候需先轉(zhuǎn)錄成RNA（前病毒基因組），然后再逆轉(zhuǎn)錄成子代病毒DNA。病毒編碼有逆轉(zhuǎn)錄酶，其基因結(jié)構(gòu)共有4個(gè)開(kāi)發(fā)閱讀框（ORF）：S、C、P和X，編碼7種病毒蛋白：即S區(qū)的前S1和S2蛋白和主蛋白（HBsAg），C區(qū)包括前C區(qū)及核心區(qū)，基本核心啟動(dòng)子區(qū)（BCP）位于核心區(qū)內(nèi)，C區(qū)編碼HBeAg和HBcAg蛋白，P區(qū)編碼P蛋白和X區(qū)編碼HBxAg蛋白［12］。HBV復(fù)制的過(guò)程中，通常會(huì)由于多種因素導(dǎo)致序列突變，而最常見(jiàn)的突變莫過(guò)于逆轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)常性發(fā)生的隨機(jī)錯(cuò)誤，BCP區(qū)和前C區(qū)是其中最常見(jiàn)的突變域，亦有研究表明：HBV有調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞表達(dá)和甲基化的能力，從而導(dǎo)致突變［13］。本研究的數(shù)據(jù)表明：病毒因素也有性別差異，BCP突變檢測(cè)結(jié)果為：女性HBV感染組BCP且全部為單突變，突變率為24%，且全部為攜帶者，與相關(guān)研究結(jié)果［14］（無(wú)癥狀病毒攜帶者中的前C區(qū)突變率高于慢性乙型肝炎及急性肝炎患者，它們的發(fā)生率分別為33.7%、16.1%、13.6%）較為接近；而男性HBV感染組突變率其中單突變?yōu)?6%，雙突變?yōu)?%，與女性HBV感染組結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。進(jìn)一步提示BCP突變對(duì)于男性而言，雄激素途徑在分子水平上通過(guò)靶向病毒增強(qiáng)子Ⅰ而起到增強(qiáng)HBV轉(zhuǎn)錄作用［15］，進(jìn)而加重病情，導(dǎo)致男女感染HBV后不同的臨床結(jié)局。

感染性疾病的遺傳易感性受到多種層次水平和途徑的制約，除了宿主的HLA、淋巴細(xì)胞共刺激分子及其配體和病毒因素外，還跟腸道菌群結(jié)構(gòu)及豐度相關(guān)［16］，這些因素均會(huì)直接影響感染的起始和疾病的進(jìn)程。本研究中HLA?DR13、A24、CW1、T淋巴細(xì)胞功能及病毒因素的性別差異為下一步雌激素/雄激素受體信號(hào)通路研究奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步揭開(kāi)性別差異引起的HBV感染后的不同結(jié)局，從而有的放矢地實(shí)行精準(zhǔn)治療提供思路。

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