氧化苦參堿通過抑制炎癥因子活性調(diào)控細(xì)胞凋亡基因水平改善肝硬化大鼠腸黏膜屏障功能

陳衛(wèi)國 文劍波 張瀟

萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院 1肝病內(nèi)科，2消化內(nèi)科（江西萍鄉(xiāng)337000）

肝硬化可由多種病因引起，為臨床上發(fā)生率最高的慢性肝臟疾病，引起肝臟組織彌漫性纖維化，進(jìn)而造成肝損害［1］。近年來，關(guān)于肝硬化引起胃黏膜的變化已經(jīng)進(jìn)行了較多的深入研究，而關(guān)于腸道黏膜的研究報道較少［2］。肝硬化的患者易發(fā)生細(xì)菌移位導(dǎo)致多種感染的發(fā)生，如血性腹瀉、膿液、黏液以及排便期間的腹部絞痛等腸道感染［3］。腸黏膜于腸道細(xì)菌移位中起了重要的屏障作用，故腸黏膜屏障功能對肝硬化預(yù)后及并發(fā)癥的預(yù)防有十分重要的作用［4］。目前常見關(guān)于腸道感染的治療引入免疫學(xué)治療的新方法的研究，如調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-10（interleukin?10，IL?10），阻斷T細(xì)胞，阻斷炎癥細(xì)胞遷移及附著等，且以上方法均可在一定程度上減少不良反應(yīng)的發(fā)生［5］。NF?κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可對各種促炎細(xì)胞因子基因進(jìn)行調(diào)節(jié)。目前NF?κB主要包括NF?κB?1（p50及其前體 p105）、NF?κB?2（p52和其前體p100）、p65（RelA）、c?Rel（Rel）和RelB［6］。腸道發(fā)生感染時，腸道固有層的巨噬細(xì)胞NF?κB p65的表達(dá)增加，同時TNF?α及其他細(xì)胞因子與DNA結(jié)合的活性較高［7］。在其他腸炎模型中，NF?κB p65也被高度表達(dá)，并且設(shè)計針對NF?κB p65基因mRNA翻譯起始位點(diǎn)的反義寡脫氧核苷酸可阻斷NF?κB p65表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到消除急性炎癥的作用［8］。氧化苦參堿（oxymatrine，OMT）在結(jié)腸炎的治療中臨床運(yùn)用較廣，主要是通過下調(diào)NF?κB的活性及其他炎癥細(xì)胞因子，進(jìn)而達(dá)到治療的作用［9］。但關(guān)于NF?κB p65亞基的阻斷機(jī)制及相關(guān)凋亡基因的機(jī)制尚未明確。故本實驗探究四氯化（CCl4）碳誘導(dǎo)的肝硬化大鼠模型中，OMT能否通過改變細(xì)胞凋亡基因Bcl?2和Bax表達(dá)水平及下調(diào)NF?κB活性以及抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放來改善腸黏膜屏障功能。

1 材料與方法

1.1 材料 選取正常雄性SD大鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司）50只，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，取10只不經(jīng)處理的大鼠視為對照組，余下40進(jìn)行肝硬化模型制備，制成肝硬化成模大鼠共30只。30只肝硬化成模大鼠分為2組，分別為模型組和治療組，每組各15只。

1.2 研究方法

1.2.1 模型制備 采用四氯化碳皮下注射法進(jìn)行大鼠肝硬化模型制備。40%四氯化碳橄欖油溶液，按照0.3 mL/kg進(jìn)行皮下注射，首次劑量加倍，每周2次，持續(xù)注射12周［10］。分別于第4、8、12周各抽取大鼠1只，用于病理織學(xué)檢查，12周后，制成的肝硬化成模大鼠共30只。

1.2.2 干預(yù)方法 治療組大鼠給予5%葡萄糖溶液配置的OMT肌注（63 mg/kg），1次/d，持續(xù)4周；對照組、模型組大鼠均給予5%葡萄糖溶液（63 mg/kg）肌注，1次/d，持續(xù)4周。同時，模型組與治療組繼續(xù)給予40%四氯化碳欖油溶液皮下注射，直至16周。

1.2.3 標(biāo)本采集 麻醉采用3%水合氯醛，麻醉后打開腹腔，取肝右葉組織（1 cm×1 cm×1 cm）標(biāo)本，0.9%生理鹽水沖洗，后經(jīng)固定，脫水、石蠟包埋，切片后行HE染色，用作病理織學(xué)檢查。另取末段回腸組織6～8 cm，用0.9%生理鹽水沖洗，分為4等份，2份用于腸道病理組織學(xué)及免疫組織化學(xué)檢查；另外2份存儲于液氮罐中，分別用于ELI?SA檢測及RT?PCR檢測。

1.3 評價指標(biāo)

1.3.1 病理損傷評分標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)WALLACE等［11］結(jié)腸宏觀評分系統(tǒng)來評估黏膜損傷的程度。潰瘍：局灶性充血，無潰瘍?yōu)?分；潰瘍，無充血/腸壁增厚為2分；潰瘍，一處發(fā)炎為3分；潰瘍，兩處或多處發(fā)炎為4分；主要傷口＞1 cm為5分；主要傷口＞2 mm為6～10分。附著力：輕微（結(jié)腸容易與其他組織分離）為1分；嚴(yán)重為2分。腹瀉：腸壁增厚為1分。

1.3.2 TNF?α和IL?6檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定法。將部分冷凍回腸組織切成片，加入少量的0.9%生理鹽水研磨成勻漿，4 000 r/min離心20 min，取上清用于TNF?α和IL?6濃度的測定。嚴(yán)格按照TNF?α和IL?6 ELISA試劑盒（晶美生物工程有限公司，中國深圳）說明書步驟進(jìn)行操作。

1.3.3 免疫組化檢測 使用K75619A試劑盒（中山金橋生物科技有限公司，中國北京）進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究，可用于回腸內(nèi)NF?κB p65的可視化觀察。正常山羊血清封閉，室溫孵育15 min，然后將載玻片與大鼠NF?κB p65的抗體（Santa Cruz Biotech，美國）一起溫育，用蘇木精復(fù)染，于光學(xué)顯著鏡下進(jìn)行觀察，胞漿或細(xì)胞核內(nèi)的陽性表達(dá)呈黃色或棕色。于400倍放大倍率的視野中，隨機(jī)計數(shù)100個細(xì)胞，計算染色的細(xì)胞的比例。

1.3.4 實時聚合酶鏈反應(yīng) 通過RT?PCR檢測在回腸組織中TNF?α、IL?6及NF?κB p65 mRNA的表達(dá)水平及凋亡基因Bcl?2和Bax的RNA的合成。根據(jù)市售總RNA提取試劑盒說明書（RNeasy Mini Kit，QIAGEN Inc.，日本）將分離的RNA逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增。引物序列見表1。將總RNA（2 μg）在45℃逆轉(zhuǎn)錄60 min并在95℃變性10 min。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過Quantity One軟件（Bio?Rad，Hercules，CA，USA）進(jìn)行拍照和定量分析。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差（one?way ANOVA）分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組體質(zhì)量及細(xì)胞因子表達(dá)比較 3組經(jīng)實驗干預(yù)后，對照組體質(zhì)量無明顯下降，TNF?α、IL?6、NF?κB p65處于低水平，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；模型組體質(zhì)量明顯下降，細(xì)胞因子TNF?α、IL?6、NF?κB p65處于高水平；治療組體質(zhì)量較模型組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），細(xì)胞因子TNF?α、IL?6、NF?κB p65較模型組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 3組體質(zhì)量、TNF?α、IL?6及NF?κB比較Tab.2 Comparison of body weight，TNF?α，IL?6 and NF?κB in the three groups±s

表2 3組體質(zhì)量、TNF?α、IL?6及NF?κB比較Tab.2 Comparison of body weight，TNF?α，IL?6 and NF?κB in the three groups±s

注：與模型組相比，aP＜0.05，bP＜0.01

組別對照組模型組治療組n 10 13 15體質(zhì)量（kg）240.3±16.9b 194.9±18.5 227.4±18.8b TNF?α（pg/mL）46.63±18.73b 152.52±15.81 97.93±17.79a IL?6（pg/mL）50.88±22.13b 118.82±35.71 78.07±24.94a NF?κB p65（%）28.10±9.88b 78.67±8.49 52.20±11.04b

2.2 組織病理學(xué)結(jié)果 回腸組織的病理損傷評分見圖1，未經(jīng)治療的模型組病理損傷評分顯著高于對照組與治療組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)治療后治療組的損傷評分顯著低于對照組，但要高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖1 回腸組織的病理損傷評分Fig.1 Pathological damage score of ileum tissue

各組HE的染色結(jié)果顯示，正常的大鼠腸黏膜絨毛形態(tài)（圖2A）；模型組染色結(jié)果顯示，因潰瘍杯狀細(xì)胞減少，黏膜肌層和腺體損傷（圖2B）；治療組觀察到杯狀細(xì)胞增加和浸潤性炎性細(xì)胞減少（圖2C）。

2.3 TNF?α和IL?6在回腸組織中的濃度 與對照組相比，模型組的TNF?α和IL?6表達(dá)水平，顯著上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；治療組經(jīng)OMT治療后，TNF?α和IL?6表達(dá)水平下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.4 免疫組化結(jié)果 NF?κB p65主要于上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核和胞漿中表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示，模型組NF?κB p65的表達(dá)水平最強(qiáng)（圖3A），而對照組相對較弱（圖3B），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。治療組與模型組相比，NF?κB p65表達(dá)量較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。模型組陽性染色細(xì)胞比例顯著高于其他2組（P＜0.05），見表2。

2.5 回腸組織mRNA表達(dá)水平 見圖4，模型組TNF?α、IL?6、Bax及NF?κB p65 mRNA的表達(dá)水平顯著高于對照組，差異與其他各組具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；治療組TNF?α、IL?6、Bax及NF?κB p65 mRNA的表達(dá)水平顯著低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而模型組的Bcl?2 mRNA的表達(dá)水平顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而治療組的Bcl?2 mRNA 顯著高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

圖2 3組回腸組織HE染色結(jié)果對比（×400）Fig.2 Comparison of HE staining results of three groups of ileum（× 400）

圖3 3組回腸組織NF?κB p65免疫組織化學(xué)染色圖（SP×400）Fig.3 Three groups of ileum tissue NF?κB p65 immunohistochemical staining（SP × 400）

圖4 各組TNF?α、IL?6、NF?κB p65、Bcl?2及Bax mRNA的表達(dá)水平Fig.4 The expression levels of TNF?α，IL?6，NF?κB p65，Bcl?2 and Bax mRNA in each group

本研究結(jié)果顯示，OMT可以有效改善四氯化碳制備的大鼠肝硬化模型回腸組織中的炎癥、潰瘍及細(xì)胞浸潤等。同時OMT亦可對細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而抑制回腸組織中NF?κB p65的表達(dá)。有研究顯示，Cox?2、IL?1、IL?6、TNF?α和 TGF?β等炎癥因子受NF?κB調(diào)節(jié)，以上炎癥因子均可引起炎癥及肝纖維化，對于肝硬化形成起著十分重要的作用［12］。炎癥反應(yīng)與肝細(xì)胞凋亡過程息息相關(guān)，這是肝纖維化的重要機(jī)制。當(dāng)肝細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞凋亡并且不能再生時，凋亡性肝細(xì)胞被豐富的細(xì)胞外基質(zhì)代替［13］。

關(guān)于TNF?α參與腸黏膜屏障功能障礙的機(jī)制較為明確，TNF?α于炎癥級聯(lián)反應(yīng)中扮演十分重要的角色，其具有產(chǎn)生快，到達(dá)高峰的時間短等特點(diǎn)［14］。TNF?α是急性肝衰竭細(xì)菌入侵腸黏膜的重要介質(zhì)［15］。IL同屬細(xì)胞因子，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的IL家庭成員有15個，參與了諸多生理及病理反應(yīng)［16］。其中IL?6是重要的致炎細(xì)胞因子，與腸黏膜屏障損傷顯著相關(guān)［13］。研究［17］顯示，肝硬化患者血漿中TNF?α和IL?6水平較高。同時本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)OMT治療后，腸道TNF?α和IL?6水平下調(diào)及mRNA表達(dá)下降，大鼠腸黏膜屏障功能得到改善。表明OMT有一定的抗炎作用，可在一定程度上降低炎癥因子的表達(dá)，達(dá)到保護(hù)腸屏障功能的作用。這與現(xiàn)有研究結(jié)果一致，腸道中TNF?α濃度水平的升高與腸屏障損失有關(guān)聯(lián)［18］。同時，IL?6能改變培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin?2的表達(dá)和腸道通透性［19］。故TNF?α和IL?6與肝硬化腸黏膜屏障損傷有密切關(guān)聯(lián)。

NF?κB為淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫炎癥應(yīng)答過程［20］。NF?κB對各種基因的啟動子具有調(diào)節(jié)作用，可對整個炎癥過程進(jìn)行調(diào)控。TOMASELLO等［21］研究表明，NF?κB p65是腸道感染的主要因素。本研究中，NF?κB p65表達(dá)量與細(xì)胞因子（IL?6和TNF?α）水平呈正相關(guān)，表明它們在肝硬化腸黏膜屏障的損傷中起著重要作用。因此，抑制NF?κBp65的表達(dá)是治療腸黏膜屏障損傷的有效方法。NF?κB p65亦可介導(dǎo)炎癥因子如IL?6基因的轉(zhuǎn)錄激活并調(diào)節(jié)其表達(dá)。本研究中，OMT可以減少NF?κB p65 mRNA及其相應(yīng)蛋白的表達(dá)，同時可降低TNF?α和IL?6的表達(dá)水平。研究顯示，NF?κB DNA可減少白細(xì)胞集聚，同時亦可使IL?6和TNF?α濃度水平下降，從而達(dá)到治療腸道感染的效果［22］。

此外，考慮到Bcl?2/Bax信號傳導(dǎo)是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵，是內(nèi)源性細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，本研究通過檢測Bcl?2、Bax的表達(dá)水平，研究其凋亡作用。研究顯示，Bcl?2上調(diào)同時Bax下調(diào)，Bcl?2/Bax比例改變可抑制凋亡［23］。本研究結(jié)果與之一致，模型組Bax mRNA的表達(dá)水平顯著高于對照組；治療組Bax mRNA的表達(dá)水平顯著低于模型組。而模型組的Bcl?2 mRNA的表達(dá)水平顯著低于對照組（P＜0.05），治療組的Bcl?2 mRNA 顯著高于模型組（P＜0.05）?？傊?，NF?κB p65信號傳導(dǎo)和Bcl?2/Bax信號協(xié)同支持肝細(xì)胞存活并抑制肝纖維化的發(fā)生。

綜上，OMT可以通過調(diào)節(jié)NF?κB p65信號傳導(dǎo)來明顯改善CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化，通過Bcl?2/Bax比例改變抑制肝細(xì)胞凋亡。然而，OMT作為肝纖維化治療劑的作用需要進(jìn)一步研究，需要對OMT的抗纖維化作用機(jī)制進(jìn)行更加深入全面的了解。

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