表沒食子兒茶素沒食子酸酯對黃曲霉毒素B1誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷的抗氧化作用

趙靜芳 鄧志杰 肖德強(qiáng) 黃豐 高偉 張勇勝 潘劍 鄧祥發(fā) 魯力廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西高校高發(fā)疾病預(yù)防與控制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南寧500）；廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（南寧 500）；廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（南寧500）

黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是由廣泛存在于自然界中的黃曲霉和寄生曲霉所產(chǎn)生的一種毒素，其毒性是氰化物的10倍、砒霜的68倍，同時(shí)還具有致突變性、致畸性和致癌性。AFB1主要污染糧油及其制品，如花生、玉米、大米、棉籽、花生油、玉米油等。在高溫高濕地區(qū)，一些糧油及其制品在生長、收獲和儲存過程中較易被污染，對人類健康構(gòu)成極大威脅［1］。目前我國AFB1污染問題仍舊十分嚴(yán)峻，如何減少或消除AFB1的攝入及對機(jī)體健康的影響，降低肝癌造成的危害成為難題。AFB1導(dǎo)致的肝癌屬于高度惡性腫瘤，病程短、進(jìn)展快、治療難、易復(fù)發(fā)，如果僅依靠現(xiàn)有治療方法難以有效遏制癌細(xì)胞的蔓延，預(yù)防才是控制疾病最具成本效益的長期戰(zhàn)略。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是從綠茶中提取分離出的最有效的生物活性物質(zhì)。隨著人們對它的深入研究，越來越多的證據(jù)表明EGCG具有抗氧化［2］、抗炎癥［3］、抗腫瘤［4-5］和保護(hù)免疫系統(tǒng)［6］、神經(jīng)系統(tǒng)［7］及心腦血管系統(tǒng)［8］、緩解代謝綜合征［9］等方面的作用。EGCG在干預(yù)AFB1引起的肝損傷作用方面，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道，具有廣闊的研究前景。本研究旨在探討EGCG抗AFB1致急性肝損傷的干預(yù)作用，同時(shí)為EGCG干預(yù)AFB1引起肝損傷提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只SPF級雄性Sprague?Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號SCXK桂2014?0002）。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝取食物（斯萊克普通標(biāo)準(zhǔn)飼料）和水，養(yǎng)殖環(huán)境12 h晝夜交替，溫度（23±1）℃，濕度（70±10）%。

1.2 主要試劑與儀器主要試劑AFB1（美國Sigma公司）；EGCG（成都普瑞法公司）；DMSO（法國MP公司）；過氧化氫酶（CAT）、總超氧化物歧化酶（SOD）、總谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Beckman Allegra X?15R離心機(jī)；日立7600?020全自動(dòng)生化分析儀；life EVOS FL全自動(dòng)熒光倒置顯微鏡；LEI?CA TP1020組織脫水機(jī)；LEICA EG1160組織包埋機(jī)；LEICA RM2235輪轉(zhuǎn)切片機(jī)；Thermo Multiskan全波長酶標(biāo)讀數(shù)儀。

1.3 動(dòng)物分組及處理 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為空白組、AFB1組、EGCG低劑量干預(yù)組（簡稱低E干預(yù)組）、EGCG高劑量干預(yù)組（簡稱高E干預(yù)組）以及EGCG組，每組10只。低E干預(yù)組灌胃25 mg/kg EGCG，高E干預(yù)組及EGCG組灌胃100 mg/kg EGCG，空白組及AFB1組則灌胃0.5 mL雙蒸水，每天1次，持續(xù)5 d。AFB1組、低E和高E干預(yù)組于第6天單劑量腹腔注射AFB12 mg/kg，空白組及EGCG組則予以等量雙蒸水腹腔注射，染毒后各組大鼠繼續(xù)以EGCG或雙蒸水繼續(xù)灌胃。所有大鼠于AFB1給藥48 h后稱量大鼠終體質(zhì)量，腹腔注射1%苯巴比妥麻醉后打開腹腔腹主靜脈取血，取血后迅速移除肝臟并用預(yù)冷生理鹽水清洗后吸干稱重，剪肝大葉一塊約0.5 cm×0.5 cm×1 cm大小的組織浸泡在福爾馬林溶液中，充分固定后用于組織病理學(xué)研究，其余肝組織則用凍存管分裝后于液氮急凍，保存于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 指標(biāo)與方法 臟器指數(shù)計(jì)算：肝指數(shù)（%）=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%；脾指數(shù)（%）=脾濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%；腎指數(shù)（%）=腎濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。血清肝功能指標(biāo)的測定：所取血樣靜置約1 h，3 500 r/min、4℃離心10 min分離制備血清。用日立自動(dòng)生化分析儀檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）含量。肝組織病理學(xué)檢驗(yàn)（HE染色）：肝組織在福爾馬林溶液中充分固定后，經(jīng)過脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、撈片、烤片、脫蠟、復(fù)水、蘇木素染色、洗脫、伊紅復(fù)染、清洗、晾片、封片一系列步驟后，通過光學(xué)顯微鏡觀察肝組織結(jié)構(gòu)及其病理變化。肝組織抗氧化指標(biāo)的測定：取適量肝臟組織，用電動(dòng)勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，按試劑盒說明書對CAT、GSH、SOD水平進(jìn)行測定；取適量血清，按試劑盒說明書對MDA水平進(jìn)行測定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，分析前先檢查方差齊性，方差齊時(shí)采用最小顯著差法，方差不齊時(shí)采用Tamhane′s法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活及生長狀況 實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠均無死亡。空白組大鼠毛色正常、順滑有光澤，正?；顒?dòng)，精神狀態(tài)、食欲良好；AFB1組大鼠精神萎靡，毛色黯淡，活躍度及食欲有所下降；而EGCG干預(yù)組大鼠與AFB1組相比，生長狀況有不同程度的改善；EGCG組與空白組相比，沒有變化。

2.2 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠的體質(zhì)量變化及臟器指數(shù)的影響 與空白組比較，EGCG組沒有變化，但AFB1組大鼠不僅體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），而且肝、脾、腎指數(shù)明顯升高（P＜ 0.05）；與AFB1組比較，EGCG干預(yù)組體質(zhì)量明顯升高，肝、脾、腎指數(shù)明顯降低（P＜0.05）；EGCG組與空白組相比，體質(zhì)量、脾、腎指數(shù)沒有變化，見表1。

2.3 大鼠肝組織病理學(xué)變化（HE染色） 各組肝組織病理學(xué)HE染色代表圖見圖1。空白組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉的構(gòu)造完好清晰，肝細(xì)胞以中央門靜脈為核心呈放射狀整齊排列，肝細(xì)胞多呈多邊形，邊緣清晰，細(xì)胞核呈圓形，位于細(xì)胞中心，核仁清晰，胞質(zhì)均勻；與空白組相比，AFB1組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，肝小葉內(nèi)可見散在肝細(xì)胞點(diǎn)，同時(shí)出現(xiàn)了點(diǎn)片狀壞死，匯管區(qū)明顯增大且炎癥細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，核大，有的可見雙核，細(xì)胞形態(tài)各異、大小不均；EGCG干預(yù)組的肝組織切片顯示，雖各劑量干預(yù)組均可見不同程度的病變，但其肝小葉結(jié)構(gòu)都已基本恢復(fù)正常，肝細(xì)胞索排列規(guī)則，肝細(xì)胞變性及腫脹程度明顯減輕，匯管區(qū)炎癥浸潤明顯得到了抑制，低E干預(yù)組效果優(yōu)于高E干預(yù)組；EGCG組相對于空白組沒有差異。由此可見，EGCG可以減輕AFB1所致大鼠的急性肝損傷，同時(shí)表明100 mg/kg EGCG對大鼠肝臟無影響。

表1 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)影響Tab.1 Effect of EGCG on body weight and visceral index of AFB1induced acute liver injury in rats（n=10） ±s

表1 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)影響Tab.1 Effect of EGCG on body weight and visceral index of AFB1induced acute liver injury in rats（n=10） ±s

注：與空白組比較，aP＜0.05；與AFB1組比較，bP＜0.05

組別空白組AFB1組低E干預(yù)組高E干預(yù)組EGCG組體質(zhì)量244.90±11.69 225.60±13.72a 228.30±6.80a 236.3±14.01 242.3±3.83b肝指數(shù)0.029±0.001 0.033±0.002a 0.030±0.002b 0.029±0.002b 0.027±0.001ab脾指數(shù)0.002 1±0.000 4 0.002 6±0.000 4a 0.002 4±0.000 3a 0.002 2±0.000 4b 0.002 3±0.000 3腎指數(shù)0.007 5±0.000 5 0.008 5±0.000 7a 0.007 6±0.000 5b 0.007 5±0.000 3b 0.007 4±0.000 5b

圖1 EGCG抗AFB1致大鼠急性肝損傷作用的病理學(xué)觀察Fig.1 Pathological observation on the effect of EGCG on acute liver injury induced by AFB1in rats（HE staining，×200）

2.4 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠血清肝功能的影響 AFB1染毒后，大鼠肝功能指標(biāo)ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP相較于空白組均有明顯升高（P＜0.05），而EGCG各劑量干預(yù)后可顯著降低AFB1對大鼠肝臟的損傷作用，其肝功能指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)（與AFB1組相比，P＜0.05）。EGCG組與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP的影響Tab.2 Effect of EGCG on serum ALT，AST，TBIL，DBIL and ALP in rats with acute liver injury induced by AFB1（n=10）±s

表2 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP的影響Tab.2 Effect of EGCG on serum ALT，AST，TBIL，DBIL and ALP in rats with acute liver injury induced by AFB1（n=10）±s

注:與空白組比較，aP＜0.05；與AFB1組比較，bP＜0.05

組別空白組AFB1組低E干預(yù)組高E干預(yù)組EGCG組ALT（U/L）53.80±6.91 4 184.00±364.53a 2 639.00±346.54ab 1 908.00±246.98ab 55.80±6.80b AST（U/L）111.10±10.38 5 422.20±265.70a 3 536.20±282.88ab 2 513.10±449.24ab 128.10±21.11b TBIL（μmol/L）2.27±0.34 33.75±3.41a 21.10±3.79ab 13.97±3.29ab 2.47±0.51b DBIL（μmol/L）0.68±0.18 20.55±2.36a 12.66±2.04ab 5.81±2.13ab 0.54±0.26b ALP（U/L）226.60±39.17 461.00±20.26a 321.30±33.56ab 282.80±35.18ab 277.20±60.49b

2.5 EGCG對AFB1所致急性肝損傷大鼠抗氧化能力的影響 AFB1染毒可致大鼠抗氧化能力明顯下降，與空白組相比其肝組織CAT、GSH、SOD水平降低（P＜0.05），血清MDA水平升高（P＜0.05）；EGCG干預(yù)后其抗氧化能力有所恢復(fù)，與AFB1組相比大鼠肝組織CAT、GSH、SOD水平增高（P＜0.05），血清MDA水平降低（P＜0.05）。EGCG組與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠肝組織CAT、GSH、SOD及血清MDA水平的影響Tab.3 Effect of EGCG on SOD and MDA levels in liver tissue of AFB1induced acute liver injury in rats（n=10） ±s

表3 EGCG對AFB1致急性肝損傷大鼠肝組織CAT、GSH、SOD及血清MDA水平的影響Tab.3 Effect of EGCG on SOD and MDA levels in liver tissue of AFB1induced acute liver injury in rats（n=10） ±s

注：與空白組比較，aP＜0.05；與AFB1組比較，bP＜0.05

組別空白組AFB1組低E干預(yù)組高E干預(yù)組EGCG組CAT（U/mg prot）82.44±4.34 48.55±11.06a 66.11±12.24ab 68.09±9.94ab 79.48±7.13b GSH（μmol/L）2 203.05±207.29 1 145.97±260.36a 1 495.49±213.60ab 1 712.04±159.34ab 2 421.03±294.74b SOD（U/mg prot）390.32±26.03 295.67±32.37a 362.15±49.86b 373.37±42.43b 395.36±56.92b血清MDA（nmol/mL）2.14±0.23 8.93±2.08a 4.90±2.56b 4.60±1.67ab 2.44±0.22b

3 討論

肝癌是世界上第6大最常見的癌癥，也是全世界癌癥死亡的3大主要原因之一［10］。據(jù)報(bào)道，我國每年約有38.3萬人死于肝癌，是全世界肝癌死亡病例數(shù)的51%，且發(fā)病和死亡水平居高不下，對居民生命健康危害極大，嚴(yán)峻的局勢給我國社會及醫(yī)療帶來了沉重的負(fù)擔(dān)［11］。流行病學(xué)研究表明，AFB1污染誘發(fā)的肝癌易發(fā)生于氣候炎熱潮濕的發(fā)展中國家，如東南亞地區(qū)以及撒哈拉以南的非洲地區(qū)；在我國則呈現(xiàn)出南高北低的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)研究證明，EGCG可從誘導(dǎo)凋亡、周期阻滯、信號傳導(dǎo)、抑制腫瘤侵襲等多方面多途徑多靶點(diǎn)地抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，從而安全有效地預(yù)防腫瘤發(fā)生。HAN等［12］的實(shí)驗(yàn)通過EGCG在氧化應(yīng)激作用機(jī)制下活化Nrf2信號通路，抑制了砷引起的肝臟病理損傷及氧化損傷，表明EGCG具有較好的預(yù)防化學(xué)性肝損傷作用。EGCG是從綠茶中提取的一種具備高效生物活性、無毒無害的化合物，是天然的自由基清除劑和抗氧化劑［13］，更是成為腫瘤預(yù)防藥物的安全選擇，且目前已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域。

研究證實(shí)ALT、AST是存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)的可溶性酶，當(dāng)肝組織、肝細(xì)胞遭受損害時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，ALT、AST釋放入血，故血清ALT、AST水平的高低可反映肝細(xì)胞損傷程度［14］。在本實(shí)驗(yàn)中，使用EGCG進(jìn)行干預(yù)后的AFB1染毒大鼠，能夠有效降低血清中ALT、AST水平，這表明EGCG能夠起到干預(yù)AFB1所致肝損傷的作用?？寡趸烙到y(tǒng)包括內(nèi)源性和外源性兩大部分，內(nèi)源性防御系統(tǒng)主要包括SOD、CAT、血紅素加氧酶和非酶低分子量清除劑（如GSH），外源性防御系統(tǒng)為抗氧化劑，根據(jù)其來源可分為天然抗氧化劑（如類胡蘿卜素，飲食為主要來源），及由工業(yè)合成的合成抗氧化劑（如n?乙酰半胱氨酸），兩大系統(tǒng)的共同作用能夠維持或重建氧化還原穩(wěn)態(tài)［15］。AFB1致肝損傷的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，肝臟酶系在代謝過程中生成大量自由基，而這些自由基又可直接攻擊細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、DNA等，其中脂質(zhì)過氧化是自由基介導(dǎo)損傷的主要表現(xiàn)之一，細(xì)胞抗氧化酶水平降低，引起機(jī)體氧化應(yīng)激損傷［16-17］。MDA是脂質(zhì)過氧化過程中的重要產(chǎn)物，它反映了體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的氧化程度和細(xì)胞遭受自由基損傷的程度；SOD為最重要的抗氧化酶之一，有著防止細(xì)胞氧化損傷的作用；GSH、CAT能夠間接地反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度［18-19］。

本實(shí)驗(yàn)降低了AFB1染毒大鼠血清MDA水平，同時(shí)提高了肝組織CAT、SOD和GSH水平，提示EGCG能夠起到干預(yù)AFB1所致肝損傷的作用，其機(jī)制可能為在內(nèi)源性和外源性防御系統(tǒng)的共同作用下，提高了體內(nèi)自由基清除劑水平及抗氧化酶的活性，阻止了脂質(zhì)過氧化過程，從而影響膜流動(dòng)性、破壞了膜蛋白，通過減少氧化應(yīng)激保護(hù)了機(jī)體免受氧自由基的攻擊，但其具體分子作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

本研究初步揭示了EGCG對AFB1致大鼠急性肝損傷的干預(yù)作用與機(jī)制，為今后對AFB1致（亞）慢性肝損傷和肝癌的干預(yù)研究奠定了基礎(chǔ)，也為今后預(yù)防AFB1肝損傷作用的膳食指導(dǎo)及其治療藥物的開發(fā)提供了理論依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)研究對象為動(dòng)物，所取標(biāo)本為動(dòng)物組織，與人體病理機(jī)制有一定差距，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)未從分子機(jī)制上深入探討，從而未能從多方面驗(yàn)證EGCG干預(yù)AFB1所致肝損傷的效果。人體有效的臨床實(shí)驗(yàn)研究及分子機(jī)制有待進(jìn)行，方可進(jìn)一步驗(yàn)證EGCG對AFB1所致肝損傷的干預(yù)效果。

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